Hodnotenie rôznych metód mikroskopie s vysokým rozlíšením
Pre konvenčnú svetelnú mikroskopiu obmedzuje difrakcia svetla rozlíšenie zobrazenia na približne 250 nm. Dnes to môžu techniky s vysokým rozlíšením zlepšiť viac ako 10-násobne. Táto technika sa dosahuje najmä tromi metódami: jednomolekulovou lokalizačnou mikroskopiou vrátane fotosenzitívnej lokalizačnej mikroskopie (PALM) a stochastickou optickou rekonštrukčnou mikroskopiou (STORM); štruktúrovaná iluminačná mikroskopia (SIM); a mikroskopia stimulovanej emisnej deplécie (STED). Ako si vybrať technológiu s vysokým rozlíšením je to, čo každého zaujíma. "Bohužiaľ, neexistujú žiadne jednoduché princípy na rozhodovanie, ktorú metódu použiť," hovorí Mathew Stracy, postdoktorandský výskumník na Oxfordskej univerzite vo Veľkej Británii. "Každý má svoje výhody a nevýhody." Vedci samozrejme tiež zisťujú, ako zvoliť správnu metódu pre konkrétny projekt. "V kontexte biozobrazovania kľúčové faktory, ktoré je potrebné zvážiť, zahŕňajú: priestorové a časové rozlíšenie, citlivosť na poškodenie svetlom, kapacitu označovania, hrúbku vzorky a fluorescenciu pozadia alebo autológnu fluorescenciu buniek." Ako to funguje Rôzne mikroskopy s vysokým rozlíšením fungujú rôznymi spôsobmi. V prípade PALM a STORM je v danom momente excitovaná alebo fotoaktivovaná iba malá časť fluorescenčných markerov, čo umožňuje ich nezávislú lokalizáciu s vysokou presnosťou. Prechod týmto procesom so všetkými fluorescenčnými značkami vedie k úplnému obrazu v super rozlíšení.
Stefan Hell, jeden z nositeľov Nobelovej ceny za chémiu za rok 2014 a riaditeľ Inštitútu biofyzikálnej chémie Maxa Plancka, povedal: „Systém PALM/STORM sa dá pomerne ľahko nastaviť, ale je ťažké ho aplikovať, pretože fluorescenčné Skupina musí mať schopnosť fotoaktivácie. Obmedzenia Nevýhodou je, že potrebujú detegovať jednu fluorescenčnú molekulu v kontexte bunky a sú menej spoľahlivé ako STED." STED používa laserový impulz na excitáciu fluorofóru a prstencový laser na zhášanie fluorofóru, pričom pre superrozlíšenie zostáva len stredná fluorescencia veľkosti nanometrov. Naskenovaním celej vzorky sa vytvorí obrázok. „Výhodou STEDu je, že ide o tlačidlovú technológiu,“ vysvetlil Hell. "Funguje to ako štandardný konfokálny fluorescenčný mikroskop." Môže tiež zobrazovať živé bunky pomocou fluorofórov, ako sú zelené alebo žlté fluorescenčné proteíny a farbivá odvodené od rodamínu. Parametrické porovnanie Hoci všetky techniky superrozlíšenia prekonávajú konvenčnú svetelnú mikroskopiu z hľadiska rozlíšenia, navzájom sa líšia. SIM karta zhruba zdvojnásobuje rozlíšenie na približne 100 nm. PALM a STORM dokážu rozlíšiť 15 nm ciele. Podľa Hella STED poskytuje priestorové rozlíšenie 30 nm v živých bunkách a 15 nm v pevných bunkách. Pokiaľ ide o konkrétne aplikácie, musíme zvážiť aj pomer signálu k šumu.
V niektorých prípadoch môže nižšie rozlíšenie, ale vyššie SNR viesť k lepšiemu obrazu ako naopak (vyššie rozlíšenie, ale nižšie SNR). Veľmi dôležitá je aj rýchlosť získavania obrazu, najmä pre živé bunky. "Všetky techniky super-rozlíšenia sú pomalšie ako konvenčné techniky fluorescenčného zobrazovania, " povedal Stracy. "PALM/STORM je najpomalší, potrebuje desiatky tisíc snímok na získanie jedného obrazu, SIM potrebuje desiatky snímok a STED je technológia skenovania, takže rýchlosť získavania závisí od veľkosti zorného poľa." Okrem živých buniek alebo fixných zobrazovacích buniek chcú niektorí vedci pochopiť aj to, ako sa objekty pohybujú. Stracy sa zaujíma o pochopenie dynamiky biologických systémov v živých bunkách, nielen o statické obrazy. Kombinuje PALM so sledovaním jednotlivých častíc na analýzu dynamiky v živých bunkách. Týmto spôsobom môže priamo sledovať markerové molekuly, keď vykonávajú svoje funkcie. Domnieva sa však, že SIM nie je vhodná na štúdium týchto dynamických procesov na molekulárnej úrovni, ale pre svoju rýchlu akvizičnú rýchlosť je vhodná najmä na pozorovanie dynamiky väčších štruktúr, ako sú celé chromozómy.
Najnovšie výsledky V roku 2017 Hellov tím vo vede ohlásil mikroskop MINFLUX s vysokým rozlíšením. Podľa Hella táto metóda superrozlíšenia prvýkrát dosahuje priestorové rozlíšenie 1 nm. Okrem toho dokáže sledovať jednotlivé molekuly v živých bunkách najmenej 100-krát rýchlejšie ako iné metódy. Iní vedci tiež chválili mikroskop MINFLUX. "Neustále sa vyvíjajú nové aplikácie a prístupy, ale pre mňa sú pozoruhodné dva pokroky," povedal Shechtman. Jedným z nich je MINFLUX. "Používa dômyselný prístup na získanie veľmi presného molekulárneho polohovania." Pokiaľ ide o druhý vzrušujúci vývoj, Shechtman spomenul WE Moernera a jeho kolegov zo Stanfordskej univerzity. Moerner bol tiež nositeľom Nobelovej ceny za chémiu za rok 2014. Jeden z víťazov. Na riešenie obmedzenia rozlíšenia zobrazovania spôsobeného anizotropným rozptylom fluorescenčných jednotlivých molekúl vedci použili rôzne polarizácie excitácie na určenie orientácie a polohy molekúl. Okrem toho majú vyvinuté jemné povrchy zreníc. Tieto techniky zlepšujú schopnosť lokalizovať štruktúry. O fluorescenčných štítkoch V mnohých aplikáciách s vysokým rozlíšením na štítkoch skutočne záleží. Existujú aj spoločnosti, ktoré poskytujú súvisiace produkty.
Napríklad nemecká spoločnosť Miltenyi sa spojila so spoločnosťou Abberior, ktorú založil Stefan Hell, s cieľom poskytnúť služby konjugácie protilátok na mieru pre farbivá pre mikroskopiu s vysokým rozlíšením. Zodpovedajúce značky ponúka aj niekoľko ďalších spoločností. „Naše Nano-Boostery sú veľmi malé, len 1,5 kDa a sú vysoko špecifické,“ hovorí Christoph Eckert, marketingový riaditeľ spoločnosti ChromoTek. Tieto proteíny viažu zelené a červené fluorescenčné proteíny (GFP a RFP). Sú odvodené z fragmentov protilátok alpaky, známych ako VHH alebo nanobody, s vynikajúcimi väzbovými vlastnosťami a stabilnou kvalitou bez variácií medzi jednotlivými šaržami. Tieto markery sú vhodné pre rôzne techniky s vysokým rozlíšením vrátane SIM, PALM, STORM a STED. Ai-Hui Tang, odborný asistent na University of Maryland School of Medicine, a kolegovia použili ChromoTek's GFP-Booster a STORM na skúmanie šírenia informácií v nervovom systéme. V presynaptických a postsynaptických neurónoch našli molekulárne nanoklastre, nazývané nanokolóny. Vedci sa domnievajú, že táto štruktúra ukazuje, že centrálny nervový systém využíva jednoduché princípy na udržanie a reguláciu synaptickej účinnosti. Rôzne verzie zobrazovania v super-rozlíšení a rastúci počet metód berú vedcov ešte hlbšie do biologických tajomstiev. Prelomením difrakčného limitu viditeľného svetla môžu biológovia dokonca „blízko sledovať“ činnosť buniek.
