Stanovenie počtu mikroorganizmov - metóda priameho počítania mikroskopu!
Rast bakteriálnej populácie sa prejavuje zvýšením počtu buniek alebo zvýšením bunkovej hmoty. Metódy na určenie počtu buniek zahŕňajú metódu priameho mikroskopického počítania, metódu počítania kolónií na platni, metódu pomeru fotoelektrického oleja, metódu maximálnej pravdepodobnosti a metódu membránovej filtrácie. Metódy merania bunkovej hmoty zahŕňajú stanovenie suchej hmotnosti buniek, stanovenie určitých bunkových zložiek, ako je obsah dusíka, RNA a DNA, a stanovenie metabolitov. Stručne povedané, existuje veľa metód na meranie rastu mikroorganizmov, z ktorých každá má svoje výhody a nevýhody, a mali by sa vyberať podľa konkrétnej situácie. Tento experiment predstavuje hlavne metódu priameho počítania mikroskopom bežne používanú vo výrobe a vedeckom výskume.
1. Požiadavky na účel
1. Objasnite princíp krvného obrazu.
2. Osvojiť si metódu počítania mikroorganizmov pomocou počítadla krviniek.
2. Základné princípy
Metóda priameho počítania pod mikroskopom je jednoduchá, rýchla a intuitívna metóda na priame počítanie malého množstva suspenzie vzorky, ktorá sa má testovať na špeciálnom sklenenom podložnom sklíčku s určitou plochou a objemom (známe aj ako počítadlo baktérií). Metódy. V súčasnosti sú bežne používané počítadlá baktérií doma aj v zahraničí: doska na počítanie krviniek, počítadlo baktérií Peteroff-Hauser a počítadlo baktérií Hawksley atď. Môžu byť použité na počítanie kvasiniek, baktérií, spór plesní a iných suspenzií, základný princíp je rovnaký. Posledné dva typy počítadiel baktérií majú celkový objem 0.02 mm3 po zakrytí krycím sklom a vzdialenosť medzi krycím sklom a sklíčkom je len 0,02 mm, takže olej imerznú šošovku objektívu možno použiť na pozorovanie a pozorovanie malých buniek, ako sú baktérie. počítať. Okrem týchto bakteriometrov existuje aj metóda odhadu pomeru plochy náteru k ploche zorného poľa pozorovaného priamo pod mikroskopom, ktorá sa všeobecne používa na bakteriologické vyšetrenie mlieka. Výhody metódy priameho počítania pod mikroskopom sú intuitívne, rýchle a jednoduché na obsluhu. Nevýhodou tejto metódy však je, že nameraným výsledkom je väčšinou súčet mŕtvych a živých buniek. V súčasnosti existujú niektoré metódy na prekonanie tohto nedostatku, ako je kombinácia farbenia mikrokomorovej kultúry životaschopnými baktériami (krátky čas) a pridanie inhibítorov bunkového delenia na dosiahnutie účelu počítania iba životaschopných baktérií.
V tomto experimente bol ako príklad na priame mikroskopické počítanie použitý hemocytometer. Informácie o použití ďalších dvoch typov počítadiel baktérií nájdete v pokynoch každého výrobcu. Počítanie priamo pod mikroskopom pomocou hemocytometra je bežne používaná metóda na počítanie mikroorganizmov. Počítacia doska je špeciálna sklenená sklíčka, na ktorej sú tri plošiny tvorené štyrmi štrbinami; širšia plošina v strede je rozdelená na dve polovice krátkou priečnou štrbinou a na každej strane plošiny je mriežka. Každá mriežka je rozdelená na deväť veľkých štvorcov a veľký štvorec v strede je miestnosť na počítanie. Štruktúra doštičky na počítanie krviniek je znázornená na obrázku l{{{{10}}}}. Mierka počítacej miestnosti má vo všeobecnosti dve špecifikácie, jedna je veľký štvorec rozdelený na 25 stredných štvorcov a každý stredný štvorec je rozdelený na 16 malých štvorcov (obrázok 15-2); druhý je veľké námestie. Štvorec je rozdelený na 16 stredných štvorcov a každý stredný štvorec je rozdelený na 25 malých štvorcov, ale bez ohľadu na to, o aký druh počítacej dosky ide, v každom veľkom štvorci je 400 malých štvorcov. Dĺžka strany každého veľkého štvorca je 1 mm a plocha každého veľkého štvorca je 1 mm2. Po zakrytí krycím sklom je výška medzi krycím sklom a podložným sklom 0,1 mm, objem počítacej komory je teda 0,lmm3 (tisícina mililitra). Obrázok 15-1 Štruktúra dosky na počítanie krviniek (1) Obrázok 15-2 Štruktúra dosky na počítanie krviniek (2) A. Pohľad spredu; B. Pozdĺžny rez; Zväčšená mriežka, veľký štvorec v strede je počítacia komora 1. Krvné bunky Platnička na počítanie; 2. Krycie sklo; 3. Pri počítaní v počítacej komore zvyčajne spočítajte celkový počet baktérií v piatich štvorcoch, potom vypočítajte priemer každého štvorca a vynásobte ho 25 alebo 16, aby ste dostali Celkový počet baktérií vo veľkom štvorci sa potom prevedie na celkový počet baktérií v 1 ml bakteriálneho roztoku. Nech je celkový počet baktérií v piatich štvorcoch A a pomer riedenia bakteriálneho roztoku je B. Ak ide o počítaciu platňu s 25 štvorcami, celkový počet baktérií v 1 ml bakteriálneho roztoku {{26} } A/5×25×104× B=50000A·B(kusy) Podobne, ak ide o počítaciu doštičku so 16 štvorcami média, celkový počet baktérií v 1 ml bakteriálneho roztoku=A/ 5×16×104×B=32000A·B (kusy)
3. Vybavenie
1. Baktérie
Saccharomyces cerevisiae
2. Nástroje alebo iné náčinie
Hemocytometer, mikroskop, krycie sklíčko, sterilné kapilárne kvapkadlo.
4. Prevádzkové kroky
1. Príprava bakteriálnej suspenzie
Saccharomyces cerevisiae sa pripravil do bakteriálnej suspenzie vhodnej koncentrácie so sterilným fyziologickým roztokom.
2. Miestnosť na počítanie mikroskopov
Pred pridaním vzoriek mikroskopicky skontrolujte počítaciu komoru počítacej platne. Ak sú nečistoty, je potrebné ich pred počítaním vyčistiť a vysušiť.
3. Pridajte vzorku
Čistý a suchý hemocytometer prikryte krycím sklíčkom a potom pomocou sterilného kapilárneho kvapkadla kvapnite malú kvapku pretrepanej suspenzie Saccharomyces cerevisiae z okraja krycieho sklíčka a nechajte bakteriálny roztok automaticky prechádzať cez medzeru kapilárnou osmózou. Pri vstupe do počítacej miestnosti môže byť všeobecná počítacia miestnosť naplnená bakteriálnou kvapalinou. Pri odbere vzoriek najprv pretrepte bakteriálny roztok; pri pridávaní vzoriek by sa v počítacej komore nemali vytvárať vzduchové bubliny.
4. Mikroskopické počítanie
Po pridaní vzorky odstavte na 5 minút, potom umiestnite hemocytometer na stolík mikroskopu, najskôr nájdite miesto počítacej komôrky pomocou mikroskopu s nízkym výkonom a potom prepnite na počítanie na vysokovýkonný mikroskop. Vhodne nastavte intenzitu svetla mikroskopu. Pri mikroskopoch, ktoré na osvetlenie používajú zrkadlá, dávajte pozor, aby ste sa neodchýlili od jednej strany svetla, inak nebude v zornom poli dobre vidieť štvorcové čiary počítacej miestnosti, prípadne budú v zornom poli iba zvislé či vodorovné čiary. byt videny. Ak sa pred počítaním zistí, že bakteriálny roztok je príliš koncentrovaný alebo príliš zriedený, je potrebné pred počítaním upraviť riedenie. Vo všeobecnosti riedenie vzorky vyžaduje približne 5 až 10 baktérií v každej malej bunke. Každá počítacia komora vyberie 5 stredných buniek (voliteľné 4 rohy a jednu strednú bunku v strede) na počítanie. Bunky umiestnené na čiare mriežky sa vo všeobecnosti počítajú iba na horných a pravých čiarach. V prípade pučania kvasiniek, keď veľkosť púčika dosahuje polovicu materskej bunky, sa počíta ako dve bakteriálne bunky. Ak chcete spočítať vzorku, vypočítajte obsah baktérií vo vzorke vypočítaním priemernej hodnoty z dvoch počítacích komôr.
5. Umyte krvný obraz
Po použití dosku na počítanie krviniek opláchnite vodou z vodovodu, nedrhnite tvrdými predmetmi a po umytí ju osušte sami alebo fénom. Mikroskopické vyšetrenie na zistenie, či sú v každej malej bunke zvyškové baktérie alebo iné sedimenty. Ak nie je čistý, treba ho opakovane umývať, kým nebude čistý.
