Rozdiely a charakteristiky medzi fluorescenčným mikroskopom a bežným optickým mikroskopom
Fluorescenčný mikroskop sa líši od bežného optického mikroskopu. Nepozoruje preparát cez osvetlenie bežného svetelného zdroja. Namiesto toho používa svetlo určitej vlnovej dĺžky (zvyčajne ultrafialové svetlo, modrofialové svetlo) na excitáciu fluorescenčného materiálu vo vzorke pod mikroskopom, čo spôsobí, že vyžaruje fluorescenciu. Svetelný zdroj fluorescenčného mikroskopu teda neslúži ako priame osvetlenie, ale ako zdroj energie, ktorý excituje vnútorný fluorescenčný materiál vzorky. Dôvod, prečo môžeme preparát pozorovať, nie je spôsobený osvetlením svetelného zdroja, ale fluorescenčným javom spôsobeným fluorescenčným materiálom vo vzorke absorbujúcim excitovanú svetelnú energiu. Je zrejmé, že hlavnou charakteristikou fluorescenčného mikroskopu je, že jeho svetelný zdroj môže dodávať veľké množstvo excitačného svetla v špecifickom rozsahu vlnových dĺžok, takže fluorescenčné látky v skúmanej vzorke môžu získať potrebnú intenzitu excitačného svetla. Zároveň musia mať fluorescenčné mikroskopy zodpovedajúce filtračné systémy. Fluorescenčná mikroskopia je základným nástrojom pre pokročilú fluorescenčnú histochémiu. Skladá sa z ultravysokotlakového svetelného zdroja, filtračného systému (vrátane excitačných a potlačovacích filtračných dosiek), optického systému a fotografického systému. Využíva svetlo určitej vlnovej dĺžky na vybudenie vzorky, aby vyžarovala fluorescenciu.
1. Spôsoby excitácie fluorescencie: Podľa rozsahu vlnových dĺžok svetla sa delí na dva typy: UV excitačná metóda (pomocou metódy ultrafialového osvetlenia) a BV excitačná metóda (pomocou modrofialového svetla). Metóda UV excitácie využíva na excitáciu takmer ultrafialové svetlo kratšie ako 400 nm. Pri tejto metóde nie je žiadne viditeľné excitačné svetlo, takže pozorovaná fluorescencia ukazuje vlastnú fluorescenciu farbiva, čo uľahčuje odlíšenie špecifickej fluorescencie na vzorke od autofluorescencie tkaniva pozadia.
2. Metóda BV excitácie: excitácia z ultrafialového na modré svetlo so stredom pri 404nm a 434nm. Táto metóda využíva modré svetlo na osvetlenie preparátu, takže medzný filter systému na pozorovanie fluorescencie musí používať filter, ktorý dokáže úplne blokovať modré svetlo a úplne prejsť požadovanou zelenou a žltou fluorescenciou. Fluorescenčné farbivá používané vo fluorescenčných protilátkových metódach. Maximálna absorpčná vlnová dĺžka excitačného svetla a maximálna emisná vlnová dĺžka fluorescencie sú relatívne blízko, takže filter používaný v BV excitačnej metóde musí používať filter s ostrou hranicou. Táto metóda môže využívať modré svetlo ako excitačné svetlo, takže absorpčná účinnosť fluorescenčných pigmentov je vyššia a možno získať jasnejšie obrázky. Nevýhodou je, že fluorescenciu pod 500 nm nie je možné vidieť, zatiaľ čo fluorescencia nad 500 nm spôsobí, že sa celý obraz javí žltý. Pri fluorescenčnej protilátkovej metóde sa špecifickosť fluorescenčného farbiva väčšinou posudzuje podľa jeho jedinečnej farby. Preto pri diskusii o jemnej špecifickosti majú často veľký vplyv vyššie uvedené nedostatky BV excitačnej metódy.
