Zlepšenie výhod multifotónovej laserovej skenovacej mikroskopie
Laserová skenovacia multifotónová mikroskopia je hlavným zlepšením oproti optickej mikroskopii. Môže pozorovať hlbokú štruktúru živých buniek, fixovaných buniek a tkanív a môže získať jasné a ostré viacvrstvové štruktúry v rovine Z, teda optické rezy, z ktorých môže zostaviť trojrozmernú pevnú štruktúru vzorky. Konfokálna mikroskopia využíva zdroj laserového svetla, ktorý po expanzii vyplní celú zadnú ohniskovú rovinu šošovky objektívu a potom prechádza cez systém šošoviek šošovky objektívu, aby sa zblížil do veľmi malého bodu v ohniskovej rovine preparátu. V závislosti od numerickej apertúry šošovky objektívu je priemer najjasnejšieho bodu osvetlenia približne 0,25 ~ 0,8 μm a hĺbka je približne 0,5 ~ 1,5 μm . Veľkosť konfokálneho bodu závisí od konštrukcie mikroskopu, vlnovej dĺžky lasera, charakteristík šošovky objektívu, nastavenia stavu skenovacej jednotky a vlastností vzorky. Rozsah osvetlenia a hĺbka osvetlenia poľného mikroskopu sú veľké, zatiaľ čo osvetlenie konfokálneho mikroskopu je sústredené na presné zaostrenie na ohniskovú rovinu. Najzákladnejšou výhodou konfokálnej mikroskopie je, že dokáže vykonávať jemné optické rezy hrubých fluorescenčných vzoriek (ktoré môžu dosiahnuť 50 μm alebo viac) a hrúbka rezov je približne 0,5 až 1,5 μm. Sériové snímky optických rezov je možné získať pohybom preparátu nahor a nadol pomocou sofistikovaného krokového motora v osi Z mikroskopu. Zber obrazových informácií je riadený v presnej rovine bez toho, aby bol rušený signálmi vysielanými z iných miest na vzorke. Po odstránení vplyvu fluorescencie pozadia a zvýšení pomeru signálu k šumu sa kontrast a rozlíšenie konfokálnych obrazov výrazne zlepšili v porovnaní s tradičnými fluorescenčnými obrázkami s osvetlením poľa. V mnohých vzorkách je mnoho zložitých štrukturálnych komponentov prepletených, aby vytvorili komplexné systémy, ale akonáhle je možné zhromaždiť dostatok optických rezov, môžeme ich pomocou softvéru rekonštruovať v troch rozmeroch. Táto experimentálna metóda bola široko používaná v biologickom výskume na objasnenie zložitých štruktúrnych a funkčných vzťahov medzi bunkami alebo tkanivami.
