Vlastnosti a aplikácie konfokálnej laserovej mikroskopie
Laserový skenovací konfokálny mikroskop (LSCM) je typ mikroskopu navrhnutý na základe technológie konjugovaného zaostrovania, čo znamená, že zdroj laserového svetla, testovaná vzorka a detektor sú vo vzájomnej konjugovanej polohe.
Základné
Vo všeobecných mikroskopoch sa ohnisková rovina šošovky objektívu zhoduje s detektorom, takže pozorovaná rovina obrazu je izolovaná od susednej axiálnej roviny, zatiaľ čo v konfokálnych mikroskopoch je vzorka osvetlená použitím svetelného bodu s obmedzenou difrakciou a v Tento izolačný efekt sa dosahuje použitím dierky v zbernej svetelnej dráhe v ohnisku bodového konjugátu na filtrovanie rozptýleného svetla na zlepšenie rozlíšenia.
Funkcie zobrazovania
Len svetlo odrazené späť od vrstvy konjugovanej vzorky môže prechádzať cez malý otvor v dráhe zberného svetla a zvyšné irelevantné odrazy vrstvy vzorky sú blokované malým otvorom. To môže viesť k výraznému zvýšeniu rozlíšenia. Nižšie je uvedené porovnanie viacrozmernej fluorescenčnej mikroskopie a konfokálnej mikroskopie rovnakej hrubej vzorky vedľa seba. Keď sa séria obrázkov nasníma v rôznych ohniskových rovinách, môže sa vygenerovať to, čo sa bežne označuje ako "z-stack", a tento obrázok ukazuje zisky rozlíšenia a kontrastu, ktoré ponúka konfokálna mikroskopia, a základné príčiny týchto ziskov. Skúmanie obrazu v hornej časti zásobníka so zobrazovacou rovinou nad tkanivom odhaľuje veľa rozptýleného svetla vo fluorescenčnom obraze, zatiaľ čo konfokálny obraz sa javí ako čierny. Toto zníženie PSF v axiálnom smere je priamo zodpovedné za rozdiel v rozlíšení pozorovanom na optickom rozhraní v strede z-zásobníka.
Ďalšou vlastnosťou laserovej skenovacej konfokálnej mikroskopie je, že ide o skenovaciu zobrazovaciu technológiu. Tradičná technológia osvetlenia so širokým poľom osvetľuje celú vzorku, takže obraz je možné priamo zachytiť voľným okom alebo detektorom, ale LSCM využíva lúč alebo viaceré zaostrené lúče prechádzajú cez vzorku na skenovanie a zobrazovanie a výsledný obraz je nazývaná optická sekcia. Nasledujúci text ukazuje rozdiel medzi tradičnou metódou osvetlenia so širokým poľom a metódou konfokálneho osvetlenia laserovým skenovaním.
Preto je na obrázku nižšie znázornená praktická pracovná metóda moderného konfokálneho mikroskopu. Excitačné svetlo emitované laserom prechádza cez dichroické zrkadlo a skenuje v smeroch x a y vzorky cez dvojicu vibrujúcich zrkadiel. Excitácia (alebo odraz) vzorky Svetlo vstupuje do PMT detektora cez dierku a je zaznamenané a zaznamenaný skenovaný obraz je rekonštruovaný počítačom, aby sa získal skutočný vzorový obraz.
