Znalosti súvisiace s fluorescenčným mikroskopom
Základný princíp konfokálnej fluorescenčnej mikroskopie: na ožiarenie preparátu sa používa bodový svetelný zdroj a na ohniskovej rovine sa vytvorí dobre definovaný malý svetelný bod. zložené zo štiepačiek. Rozdeľovač lúčov posiela fluorescenciu priamo do detektora. Pred svetelným zdrojom a detektorom je dierka, ktorá sa nazýva iluminačná dierka a detekčná dierka. Geometrická veľkosť oboch je rovnaká, približne 100-200nm; vzhľadom na svetelnú škvrnu na ohniskovej rovine sú tieto dve konjugované, to znamená, že svetelná škvrna prechádza sériou šošoviek a nakoniec môže byť súčasne zaostrená na osvetľovaciu dierku a detekčnú dierku. Týmto spôsobom môže byť svetlo z ohniskovej roviny konvergované v rámci detekčného otvoru, zatiaľ čo rozptýlené svetlo zhora alebo pod ohniskovou rovinou je blokované mimo detekčného otvoru a nemožno ho zobraziť. Laser skenuje vzorku bod po bode a trubica fotonásobiča po detekcii dierky získa aj konfokálny obraz zodpovedajúceho svetelného bodu bod po bode, ktorý sa prevedie na digitálny signál a prenesie do počítača a nakoniec sa agreguje do čistého konfokálny obraz celej ohniskovej roviny na obrazovke.
Každý obraz ohniskovej roviny je v skutočnosti optickým prierezom vzorky a tento optický prierez má vždy určitú hrúbku, tiež známu ako optický tenký rez. Keďže intenzita svetla v ohniskovom bode je oveľa väčšia ako v nezaostrovacom bode a svetlo bez ohniskovej roviny je filtrované dierkou, hĺbka poľa konfokálneho systému je približne nulová a skenovanie pozdĺž Z -axis môže realizovať optickú tomografiu, tvoriac Pozorujte dvojrozmerný optický rez na zaostrenom mieste vzorky. Kombináciou skenovania v rovine XY (ohnisková rovina) so skenovaním na osi Z (optická os) je možné získať trojrozmerný obraz vzorky akumuláciou dvojrozmerných obrazov súvislých vrstiev a spracovať pomocou špeciálneho počítačového softvéru.
To znamená, že detekčná dierka a dierka svetelného zdroja sú vždy zaostrené na rovnaký bod, takže fluorescencia excitovaná mimo ohniskovej roviny nemôže vstúpiť do detekčnej dierky.
Jednoduchým vyjadrením princípu fungovania laserového konfokálu je, že ako zdroj svetla používa laserové svetlo. Na báze tradičného zobrazovania fluorescenčným mikroskopom pridáva laserové skenovacie zariadenie a konjugované zaostrovacie zariadenie a ide o systém na digitálne získavanie a spracovanie obrazu pomocou počítačového riadenia.
