Fluorescenčná mikroskopia sa líši od bežnej mikroskopie
Fluorescenčné mikroskopy používajú ultrafialové svetlo ako zdroj svetla na ožarovanie kontrolovaného objektu, takže objekt vyžaruje svetlo a potom pozoruje objekt pod mikroskopom. Používa sa hlavne pre imunofluorescenčné bunky. Skladá sa hlavne zo svetelného zdroja, systému filtračných platní a optického systému na pozorovanie fluorescenčného obrazu vzorky prostredníctvom zväčšenia okuláru a šošovky objektívu. Poďme sa pozrieť na rozdiel medzi týmto fluorescenčným mikroskopom a obyčajným optickým mikroskopom.
1. Pozrite sa na spôsob osvetlenia
Spôsob osvetlenia fluorescenčného mikroskopu je vo všeobecnosti episkopický, to znamená, že svetelný zdroj sa premieta na testovanú vzorku cez šošovku objektívu.
2. Pozrite sa na rozlíšenie
Fluorescenčné mikroskopy využívajú ako zdroj svetla ultrafialové svetlo a vlnová dĺžka je relatívne krátka, ale rozlíšenie je vyššie ako u bežných optických mikroskopov.
3. Rozdiel vo filtri
Fluorescenčné mikroskopy používajú dva špeciálne filtre, ktoré sa používajú pred zdrojom svetla na odfiltrovanie viditeľného svetla a medzi šošovkou objektívu a okulárom na odfiltrovanie ultrafialových lúčov, ktoré môžu chrániť ľudské oči.
Fluorescenčný mikroskop je tiež druh optického mikroskopu, hlavne preto, že vlnová dĺžka excitovaná fluorescenčným mikroskopom je krátka, takže to vedie k rozdielu v štruktúre a použití medzi fluorescenčným mikroskopom a bežným mikroskopom. Väčšina fluorescenčných mikroskopov má dobrú funkciu zachytávania slabého svetla, takže pri extrémne slabej fluorescencii je dobrá aj jeho zobrazovacia schopnosť. V spojení s neustálym zdokonaľovaním fluorescenčných mikroskopov v posledných rokoch sa výrazne znížil aj hluk. Preto sa čoraz viac používa fluorescenčných mikroskopov.
pár
Znalosti o fotónovej fluorescenčnej mikroskopii
Základný princíp dvojfotónovej excitácie je: v prípade vysokej hustoty fotónov môžu fluorescenčné molekuly absorbovať dva fotóny s dlhou vlnovou dĺžkou súčasne a po krátkej životnosti takzvaného excitovaného stavu emitovať fotón s kratšou vlnovou dĺžkou; efekt je rovnaký ako pri použití fotónu s polovičnou vlnovou dĺžkou oproti dlhej vlnovej dĺžke na excitáciu fluorescenčných molekúl. Dvojfotónová excitácia vyžaduje vysokú hustotu fotónov. Aby nedošlo k poškodeniu buniek, dvojfotónová mikroskopia využíva vysokoenergetické pulzné lasery s uzamknutým režimom. Laser vyžarovaný týmto laserom má vysokú špičkovú energiu a nízku priemernú energiu, jeho šírka pulzu je iba 100 femtosekúnd a jeho frekvencia môže dosiahnuť 80 až 100 megahertzov. Pri použití šošovky objektívu s vysokou numerickou apertúrou na zaostrenie fotónov pulzného lasera je hustota fotónov v ohnisku šošovky objektívu najvyššia a k dvojfotónovej excitácii dochádza iba v ohnisku šošovky objektívu, takže dvojfotónový mikroskop nevyžaduje konfokálnu dierku, čo zlepšuje účinnosť detekcie fluorescencie.
Vo všeobecných fluorescenčných javoch môže fluorescenčná molekula v dôsledku nízkej hustoty fotónov excitačného svetla absorbovať iba jeden fotón v rovnakom čase a potom emitovať fluorescenčný fotón cez radiačný prechod, čo je jednofotónová fluorescencia. Pre proces fluorescenčnej excitácie s použitím lasera ako zdroja svetla môže nastať dvojfotónová alebo dokonca viacfotónová fluorescencia. V tomto čase je intenzita použitého zdroja excitačného svetla vysoká a hustota fotónov spĺňa požiadavky fluorescenčných molekúl absorbujúcich dva fotóny súčasne. V procese použitia všeobecného lasera ako zdroja excitačného svetla hustota fotónov stále nestačí na vytvorenie fenoménu dvojfotónovej absorpcie. Väčšinou sa používa femtosekundový pulzný laser a jeho okamžitý výkon môže dosahovať rádovo megawatty. Preto je vlnová dĺžka dvojfotónovej fluorescencie kratšia ako vlnová dĺžka excitačného svetla, čo je ekvivalentné efektu vyvolanému excitáciou pri polovičnej vlnovej dĺžke excitácie.
Dvojfotónová fluorescenčná mikroskopia má mnoho výhod:
1) Svetlo s dlhou vlnovou dĺžkou je menej ovplyvnené rozptylom ako svetlo s krátkou vlnovou dĺžkou a ľahko preniká do vzorky;
2) Fluorescenčné molekuly mimo ohniskovej roviny nie sú excitované, takže viac excitačného svetla môže dosiahnuť ohniskovú rovinu, takže excitačné svetlo môže preniknúť hlbšie do vzoriek;
3) Blízke infračervené svetlo s dlhou vlnovou dĺžkou je pre bunky menej toxické ako svetlo s krátkou vlnovou dĺžkou;
4) Pri použití dvojfotónového mikroskopu na pozorovanie preparátov dochádza k fotobieleniu a fototoxicite len v ohniskovej rovine. Preto je dvojfotónová mikroskopia vhodnejšia ako jednofotónová na pozorovanie hrubých vzoriek, na pozorovanie živých buniek alebo na experimenty bodového fotobielenia.
Znalosti o konfokálnej fluorescenčnej mikroskopii
Základný princíp konfokálnej fluorescenčnej mikroskopie: vzorka je ožiarená bodovým zdrojom svetla a na ohniskovej rovine sa vytvorí malý, dobre definovaný svetelný bod. Po ožiarení bodu sa vyžarovaná fluorescencia zhromažďuje šošovkou objektívu a posiela sa späť do rozdeľovača lúča zloženého z dichroického zrkadla pozdĺž pôvodnej dráhy osvetlenia. Rozdeľovač lúčov posiela fluorescenciu priamo do detektora. Pred svetelným zdrojom a detektorom je dierka, ktorá sa nazýva iluminačná dierka a detekčná dierka. Geometrická veľkosť oboch je rovnaká, približne 100-200nm; vzhľadom na svetelnú škvrnu na ohniskovej rovine sú tieto dve konjugované, to znamená, že svetelná škvrna prechádza sériou šošoviek a nakoniec môže byť súčasne zaostrená na osvetľovaciu dierku a detekčnú dierku. Týmto spôsobom môže byť svetlo z ohniskovej roviny konvergované v rámci detekčného otvoru, zatiaľ čo rozptýlené svetlo zhora alebo pod ohniskovou rovinou je blokované mimo detekčného otvoru a nemožno ho zobraziť. Laser skenuje vzorku bod po bode a trubica fotonásobiča po detekcii dierky získa aj konfokálny obraz zodpovedajúceho svetelného bodu bod po bode, ktorý sa prevedie na digitálny signál a prenesie do počítača a nakoniec sa agreguje do čistého konfokálny obraz celej ohniskovej roviny na obrazovke.
Každý obraz ohniskovej roviny je vlastne optickým prierezom vzorky a tento optický prierez má vždy určitú hrúbku, tiež známu ako optický tenký rez. Keďže intenzita svetla v ohniskovom bode je oveľa väčšia ako v nezaostrovacom bode a svetlo v neohniskovej rovine je odfiltrované dierkou, hĺbka poľa konfokálneho systému je približne nulová a skenovanie pozdĺž Os Z môže realizovať optickú tomografiu, čím sa vytvorí dvojrozmerný optický rez v zameranom mieste vzorky, ktorá sa má pozorovať. Kombináciou skenovania v rovine XY (ohnisková rovina) so skenovaním na osi Z (optická os) je možné získať trojrozmerný obraz vzorky akumuláciou dvojrozmerných obrazov súvislých vrstiev a spracovať pomocou špeciálneho počítačového softvéru.
To znamená, že detekčná dierka a dierka svetelného zdroja sú vždy zaostrené na rovnaký bod, takže fluorescencia excitovaná mimo ohniskovej roviny nemôže vstúpiť do detekčnej dierky.
Jednoduchým vyjadrením princípu fungovania laserového konfokálu je, že ako zdroj svetla používa laserové svetlo. Na báze tradičného zobrazovania fluorescenčným mikroskopom pridáva laserové skenovacie zariadenie a konjugované zaostrovacie zariadenie a ide o systém na digitálne získavanie a spracovanie obrazu pomocou počítačového riadenia.
