Technické parametre fluorescenčnej mikroskopie Techniky a metódy fluorescenčnej mikroskopie
Technické parametre fluorescenčného mikroskopu 1. Širokouhlý okulár 2. Achromatická šošovka objektívu 3. Štvorotvorový konvertor šošovky objektívu 4. Epifluorescenčné zariadenie Modrý (B) Zelený (G) budiaci systém 100W ortuťová výbojka 5. Koaxiálny mechanizmus hrubého a jemného nastavenia zaostrenia: nastavenie Rozsah zaostrenia: 15 mm Hodnota mriežky mikropohybu: 0,002 mm 6. Dvojvrstvový mechanický stôl Rozsah pozdĺžneho pohybu: 70 mm Rozsah bočného pohybu: 50 mm
Technické parametre fluorescenčného mikroskopu
1. Širokouhlý okulár
2. Achromatická šošovka objektívu
3. Nosový držiak so štyrmi otvormi
4. Epi-fluorescenčné zariadenie modrá (B) zelená (G) budiaci systém 100W ortuťová výbojka
5. Koaxiálny mechanizmus hrubého a jemného nastavenia zaostrenia: rozsah zaostrenia 15 mm hodnota mriežky jemného pohybu 0,002 mm
6. Dvojvrstvový mechanický pracovný stôl
Rozsah vertikálneho pohybu: 70 mm Rozsah bočného pohybu: 50 mm
Zručnosti a metódy fluorescenčnej mikroskopie
(1) Podložné sklo
Hrúbka podložného skla by mala byť medzi 0,8 až 1,2 mm. Príliš hrubé sklíčko na jednej strane pohltí viac svetla a na druhej strane sa excitačné svetlo nemôže sústrediť na preparát. Sklíčka musia byť hladké, rovnomernej hrúbky a bez zjavnej autofluorescencie. Niekedy sa používajú sklíčka z kremenného skla.
(2) Krycie sklo
Hrúbka krycieho skla je približne 0,17 mm, hladké. Na zosilnenie excitačného svetla možno použiť aj interferenčné krycie sklo, čo je špeciálne krycie sklo potiahnuté niekoľkými vrstvami látok (napr. fluorid horečnatý), ktoré majú rôzne interferenčné účinky na svetlo rôznych vlnových dĺžok, čo môže spôsobiť fluorescencia prebieha hladko. Vzrušujúce svetlo prechádza a odráža a toto odrazené excitačné svetlo excituje vzorku.
(3) Vzor
Plátky tkaniva alebo iné vzorky by nemali byť príliš hrubé. Ak je príliš hrubý, väčšina excitačného svetla sa spotrebuje v spodnej časti preparátu, zatiaľ čo horná časť priamo pozorovaná šošovkou objektívu nebude úplne excitovaná. Okrem toho prekrývanie buniek alebo kryt nečistôt ovplyvňuje posúdenie.
(4) Montážny prostriedok
Glycerín sa bežne používa ako upevňovacie činidlo, ktoré nesmie mať žiadnu autofluorescenciu, musí byť bezfarebné a priehľadné a jas fluorescencie je jasnejší pri pH 8.5-9.5 a nie je ľahké rýchlo vyblednúť. Preto sa ako upevňovacie činidlo bežne používa rovnaká zmes glycerolu a 0,5 mol/l uhličitanového tlmivého roztoku s pH 9.{6}} až 9,5.
(5) zrkadlový olej
Vo všeobecnosti platí, že pri pozorovaní vzoriek pomocou fluorescenčných mikroskopov s tmavým poľom a olejových imerzných šošoviek sa musí použiť imerzný olej. Najlepšie je použiť špeciálny nefluorescenčný imerzný olej. Namiesto toho možno použiť aj vyššie uvedený glycerín a možno použiť aj tekutý parafín, ale index lomu je nízky, čo má mierny vplyv na kvalitu obrazu. Vplyv.
Princíp a štrukturálne charakteristiky fluorescenčného mikroskopu
Fluorescenčná mikroskopia využíva bod s vysokou svetelnou účinnosťou na vyžarovanie svetla určitej vlnovej dĺžky (ako je ultrafialové svetlo 3650 palcov alebo fialové modré svetlo 4200 palcov) cez filtračný systém ako excitačné svetlo na excitáciu fluorescenčných látok vo vzorke, aby sa emitovala fluorescencia rôzne farby Potom pozorujte cez zväčšenie objektívu a okuláru. Týmto spôsobom, pod silným kontrastným pozadím, aj keď je fluorescencia veľmi slabá, je ľahko identifikovateľná a má vysokú citlivosť. Používa sa najmä na výskum bunkovej štruktúry a funkcie a chemického zloženia. Základná konštrukcia fluorescenčného mikroskopu sa skladá z bežného optického mikroskopu plus niektorého príslušenstva (ako je zdroj fluorescenčného svetla, excitačný filter, dvojfarebný rozdeľovač lúčov a blokovací filter atď.). Fluorescenčný zdroj svetla – vo všeobecnosti sa používa ultravysokotlaková ortuťová výbojka (50-200W), ktorá môže vyžarovať svetlo rôznych vlnových dĺžok, ale každá fluorescenčná látka má excitačnú vlnovú dĺžku, ktorá produkuje najsilnejšiu fluorescenciu, takže excitačný filter (vo všeobecnosti existujú ultrafialové, fialové, modré a zelené excitačné filtre), ktoré prepúšťajú iba excitačné svetlo určitej vlnovej dĺžky a ožarujú vzorku, zatiaľ čo iné svetlo pohlcujú. Každá látka po ožiarení excitačným svetlom vyžaruje vo veľmi krátkom čase viditeľnú fluorescenciu s väčšou vlnovou dĺžkou ako je vlnová dĺžka ožiarenia. Fluorescencia je špecifická a vo všeobecnosti slabšia ako excitačné svetlo. Aby bolo možné pozorovať špecifickú fluorescenciu, musí sa za šošovku objektívu pridať blokovanie (alebo potlačenie) a musí sa použiť v spojení s ňou.
Rozdiel medzi fluorescenčným mikroskopom a obyčajným mikroskopom
1. Spôsob osvetlenia je zvyčajne episkopický, to znamená, že zdroj svetla sa premieta na vzorku cez šošovku objektívu;
2. Zdrojom svetla je ultrafialové svetlo, vlnová dĺžka je kratšia a rozlíšenie je vyššie ako u bežných mikroskopov;
3. Existujú dva špeciálne filtre, jeden pred zdrojom svetla sa používa na odfiltrovanie viditeľného svetla a jeden medzi okulárom a šošovkou objektívu sa používa na odfiltrovanie ultrafialových lúčov na ochranu ľudského oka.
Fluorescenčný mikroskop je tiež druhom optického mikroskopu, hlavný rozdiel je v tom, že vlnová dĺžka excitácie týchto dvoch je odlišná. To určuje rozdiel medzi fluorescenčným mikroskopom a bežným optickým mikroskopom z hľadiska štruktúry a použitia.
Fluorescenčná mikroskopia je základným nástrojom v imunofluorescenčnej cytochémii. Skladá sa z hlavných komponentov, ako je zdroj svetla, systém filtračných dosiek a optický systém. Je to použitie určitej vlnovej dĺžky svetla na excitáciu vzorky, aby sa emitovala fluorescencia, a na pozorovanie fluorescenčného obrazu vzorky zosilnením systému šošovky objektívu a okuláru.
