Fluorescenčné pozorovanie optickým mikroskopom
Fluorescencia sa týka procesu, pri ktorom fluorescenčná látka takmer súčasne vyžaruje svetlo s dlhšou vlnovou dĺžkou, keď je ožiarená svetlom špecifickej vlnovej dĺžky (obrázok 1). Keď svetlo špecifickej vlnovej dĺžky (excitačná vlnová dĺžka) dopadá na molekulu, ako sú tie vo fluorofóre, fotónová energia je absorbovaná elektrónmi molekuly. Ďalej elektróny prechádzajú zo základného stavu (S0) do vyššej energetickej hladiny, excitovaného stavu (S1'). Tento proces sa nazýva excitácia①. Elektrón zostane v excitovanom stave 10-9–10-8 sekúnd, počas ktorých elektrón stratí určitú energiu②. Počas procesu opúšťania elektrónov z excitovaného stavu (S1) a návratu do základného stavu③ sa zvyšná energia absorbovaná počas procesu budenia uvoľňuje.
Fluorescenčný Jablonského diagram
Doba zotrvania fluorescenčnej molekuly v excitovanom stave je životnosť fluorescencie, ktorá je všeobecne na úrovni nanosekúnd a je inherentnou charakteristikou samotnej fluorescenčnej molekuly. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM), ktorá využíva technológiu fluorescenčného celoživotného zobrazovania, môže okrem zobrazovania intenzity fluorescencie vykonávať aj hlbšie funkčné merania a získať molekulárnu konformáciu, medzimolekulové interakcie a mikroprostredie molekúl atď. Informácie, ktoré je ťažké získať získať konvenčným optickým zobrazovaním.
Ďalšou dôležitou vlastnosťou fluorescencie je Stokesov posun, rozdiel vlnových dĺžok medzi excitačnými a emisnými vrcholmi (obrázok 2). Typicky je vlnová dĺžka emisie dlhšia ako vlnová dĺžka excitácie. Je to preto, že elektróny stratia časť svojej energie relaxačným procesom po excitácii fluorescenčnej látky a pred uvoľnením fotónov. Fluorescenčné látky s väčšími Stokesovými posunmi sú ľahšie pozorovateľné pod fluorescenčným mikroskopom.
fluorescenčný mikroskop
Fluorescenčný mikroskop je optický mikroskop, ktorý využíva fluorescenčné vlastnosti na pozorovanie a zobrazovanie a je široko používaný v rôznych oblastiach, ako je bunková biológia, neurobiológia, botanika, mikrobiológia, patológia a genetika. Fluorescenčné zobrazovanie má výhody vysokej citlivosti a vysokej špecifickosti a je veľmi vhodné na pozorovanie distribúcie špecifických proteínov a organel v tkanivách a bunkách, štúdium kolokalizácie a interakcie, sledovanie životných dynamických procesov, ako sú zmeny koncentrácie iónov , atď.
Väčšina molekúl v bunkách nefluoreskuje a ak ich chcete vidieť, označíte ich fluorescenčne. Existuje mnoho metód fluorescenčného značenia, ako je priame značenie (ako je použitie DAPI na značenie DNA) alebo imunofarbenie využívajúce vlastnosti protilátok viažuce antigén alebo použitie fluorescenčných proteínov (ako je GFP, zelený fluorescenčný proteín) na značenie cieľových proteínov. a obojstranná väzba. syntetické farbivá (napríklad Fura-2) atď.
Invertovaný fluorescenčný mikroskop MF53-N
V súčasnosti sa fluorescenčný mikroskop stal štandardným zobrazovacím zariadením rôznych laboratórií a zobrazovacích platforiem a je dobrým pomocníkom pre naše každodenné experimenty. Fluorescenčné mikroskopy sa delia hlavne do troch kategórií: vzpriamené fluorescenčné mikroskopy (vhodné na rezy), inverzné fluorescenčné mikroskopy (vhodné pre živé bunky, berúc do úvahy rezanie rezov), fluorescenčné stereoskopy (vhodné pre väčšie vzorky, ako sú rastliny, zebričky (dospelé/embryá). ), medaka, orgány myší/potkanov atď.).
Technológia zobrazovania fluorescenčnou mikroskopiou je široko používaná a bohatá na typy a stále sa objavujú nové technológie. Môžete si vybrať technológiu na dokončenie vlastného výskumu.
