Ako sa fluorescenčná mikroskopia líši od bežnej mikroskopie
Nedávno som sa pokúsil urobiť niekoľko zmrazených rezov myší a teraz musím použiť fluorescenčný mikroskop, aby som zistil, či sa vírus, ktorý som injikoval, nachádza v požadovanej oblasti mozgu. Niektoré základné princípy fluorescenčnej mikroskopie si treba stručne preštudovať a ja sa o ne podelím aj tu.
Fluorescenčný mikroskop používa ultrafialové svetlo ako zdroj svetla na osvetlenie testovaného objektu, čo spôsobí, že objekt vyžaruje zdroj svetla a potom objekt pozoruje pod mikroskopom. Používa sa hlavne pre imunofluorescenčné bunky a skladá sa zo zdroja svetla, systému filtračných platní a optického systému na pozorovanie fluorescenčného obrazu vzorky prostredníctvom zväčšenia okuláru a šošovky objektívu. Poďme sa pozrieť na rozdiel medzi týmto fluorescenčným mikroskopom a bežným optickým mikroskopom.
1. Z hľadiska spôsobov osvetlenia
Metóda osvetlenia fluorescenčného mikroskopu vo všeobecnosti používa metódu dopadajúceho lúča, čo znamená, že svetelný zdroj sa premieta na testovanú vzorku cez šošovku objektívu.
2. Z hľadiska rozlíšenia
Fluorescenčná mikroskopia využíva ako zdroj svetla ultrafialové svetlo s relatívne krátkou vlnovou dĺžkou, ale vyšším rozlíšením ako bežné optické mikroskopy.
3. Rozdiely na filtri
Fluorescenčný mikroskop používa dva špeciálne filtre, jeden pred zdrojom svetla na odfiltrovanie viditeľného svetla a druhý medzi objektívom a okulárom na odfiltrovanie ultrafialového svetla, ktoré môže chrániť oči.
Fluorescenčná mikroskopia je tiež typ optického mikroskopu, hlavne preto, že vlnová dĺžka excitovaná fluorescenčnou mikroskopiou je krátka, čo vedie k rozdielom v štruktúre a použití fluorescenčnej mikroskopie a bežnej mikroskopie. Väčšina fluorescenčných mikroskopov má dobrú funkciu zachytávania slabého svetla, takže ich zobrazovacia schopnosť je dobrá aj pri extrémne slabej fluorescencii. Okrem toho s neustálym zlepšovaním fluorescenčnej mikroskopie v posledných rokoch sa výrazne znížil aj šum. Preto sa čoraz viac používa fluorescenčných mikroskopov.
Poznatky súvisiace s dvojfotónovou fluorescenčnou mikroskopiou
Základným princípom dvojfotónovej excitácie je, že pri vysokej hustote fotónov môžu fluorescenčné molekuly súčasne absorbovať dva fotóny s dlhou vlnovou dĺžkou a po krátkej dobe takzvanej životnosti excitovaného stavu emitovať fotón s kratšou vlnovou dĺžkou; Jeho účinok je rovnaký ako pri použití fotónu s vlnovou dĺžkou polovičnou oproti dlhej vlnovej dĺžke na excitáciu fluorescenčných molekúl. Dvojfotónová excitácia vyžaduje vysokú hustotu fotónov a aby sa predišlo poškodeniu buniek, v dvojfotónovom mikroskope sa používa vysokoenergetický pulzný laser s uzamknutým režimom. Laser vyžarovaný týmto typom lasera má vysokú špičkovú energiu a nízku priemernú energiu so šírkou impulzu iba 100 femtosekúnd a frekvenciou až 80 až 100 megahertzov. Pri použití objektívu s vysokou numerickou apertúrou na zaostrenie fotónov pulzného lasera je hustota fotónov v ohnisku objektívu najvyššia a k dvojfotónovej excitácii dochádza iba v ohnisku objektívu. Preto dvojfotónový mikroskop nevyžaduje konfokálne dierky, čo zlepšuje účinnosť detekcie fluorescencie.
Vo všeobecných fluorescenčných javoch môže fluorescenčná molekula v dôsledku nízkej hustoty excitácie fotónov absorbovať iba jeden fotón v rovnakom čase a potom emitovať jeden fluorescenčný fotón prostredníctvom prechodu žiarenia, ktorý sa nazýva fluorescencia jedného fotónu. Pri procese fluorescenčnej excitácie s použitím lasera ako zdroja svetla sa môžu vyskytnúť javy dvojfotónovej alebo dokonca viacfotónovej fluorescencie. V tomto čase má použitý zdroj excitačného svetla vysokú intenzitu a hustota fotónov spĺňa požiadavku, aby fluorescenčné molekuly absorbovali dva fotóny súčasne. V procese použitia typického lasera ako zdroja excitačného svetla hustota fotónov stále nie je dostatočná na vytvorenie fenoménu dvojfotónovej absorpcie. Typicky sa používajú femtosekundové pulzné lasery a ich okamžitý výkon môže dosiahnuť úroveň megawattov. Preto je vlnová dĺžka dvojfotónovej fluorescencie kratšia ako vlnová dĺžka excitácie, čo je ekvivalentné efektu vyvolanému excitáciou polovičnej excitačnej vlnovej dĺžky.
