Koľko toho viete o fluorescenčnej mikroskopii
Fluorescenčné mikroskopy vo všeobecnosti používajú ako zdroje excitačného svetla ortuťové výbojky s vysokou intenzitou. Filtre sa používajú na odfiltrovanie nežiaduceho svetla, pričom zostáva len čisté svetlo vysokej intenzity, ktoré excituje fluorofór. Potom, čo monochromatické svetlo ožiari vzorku cez šošovku objektívu, vzorka bude excitovaná, aby emitovala svetlo (fluorescencia) a fluorescenčné aj excitačné svetlo sa vrátia pozdĺž optickej dráhy šošovky objektívu. V tomto prípade je potrebné dichroické zrkadlo na filtrovanie excitačného svetla. , prepúšťajúc iba fluorescenciu, ktorú potrebujeme vidieť.
Táto fluorescencia dosiahne okulár pozdĺž svetelnej dráhy mikroskopu a potom vstúpi do našich očí, kde môžeme vidieť fluorescenciu vyžarovanú fluorofórom.
Predbežná kontrola a nastavenie fluorescenčného mikroskopu:
(1) Pred každým fluorescenčným pozorovaním je potrebné rutinne kontrolovať zarovnanie vlákna, zaostrenie optickej dráhy, apertúrnu clonu a nastavenie clony poľa fluorescenčného zariadenia.
(2) Či je v konvertore nainštalovaná požadovaná zostava fluorescenčného excitačného/emisného filtra, či je šošovka objektívu fluorescenčného mikroskopu správne nakonfigurovaná a či sú na prednej šošovke šošovky objektívu odstránené olejové škvrny a prach.
(3) Ak sa súčasne vykonáva pozorovanie fázového kontrastu prechádzajúceho svetla, je potrebné skontrolovať konjugáciu stredu kondenzora a prstenca fázového kontrastu oproti šošovke objektívu.
(4) Skontrolujte, či je nosič vzorky (sklíčko, krycie sklo a iné pomôcky) pokrytý kvapalinou alebo prachom a či je hrúbka v rozsahu kalibrovanej pracovnej vzdialenosti šošovky objektívu. Nakrájaná vzorka by nemala byť príliš hrubá, najlepšie menšia alebo rovná 10 μm.
(5) Pretože zdroj osvetlenia obsahuje ultrafialové lúče, nad prednú časť stolíka je umiestnená hnedá tieniaca doska, aby sa zabránilo poškodeniu sietnice ultrafialovými lúčmi.
(6) Nestabilita napätia zníži životnosť vysokotlakovej ortuťovej výbojky a napájací zdroj svetelného zdroja je vybavený stabilizátorom napätia.
(7) Aby sa predĺžila životnosť ortuťovej výbojky, možno ju vypnúť 15 minút po zapnutí; po vypnutí napájania ortuťovej výbojky je potrebné počkať aspoň 10 minút, kým sa ortuťové výpary opäť ochladia a vrátia sa do pôvodného stavu, inak bude ovplyvnená životnosť výbojky.
Pozorovanie obrazu fluorescenčným mikroskopom:
(1) Asi 5-10 minút po zapnutí zdroja fluorescenčného svetla má intenzita excitačného svetla tendenciu byť stabilná a vzorka je zaťažená na pozorovanie; aby ste predišli zhášaniu fluorescencie vzorky spôsobenému nadmerným excitačným svetlom počas procesu zaostrovania a hľadania objektov, najskôr oddiaľte fluorescenčný mikroskop Nastavte excitačné svetlo na miernu intenzitu pomocou apertúrnej clony alebo pridajte ND filter a Pravidelne posúvajte stojan na vzorky. Po potvrdení zrkadlového obrazu nastavte na snímanie a nahrávanie fluorescenčný stav.
(2) Úpravy pre nízku kvalitu obrazu. Okrem faktorov prípravy vzorky je možné vykonať potrebné úpravy:
① Vylúčte zo zobrazovacej optickej dráhy zariadenia na tienenie alebo obmedzovanie svetla, ako sú príslušenstvo DIC, ND filtre atď.
②Upravte zaostrenie prijímača a veľkosť apertúrnej clony fluorescenčného mikroskopu.
③ Opatrne nastavte korekčný krúžok rozdielu pokrytia šošovky objektívu fluorescenčného mikroskopu.
Aplikačné body fluorescenčnej mikroskopie
Fluorescenčná mikroskopia využíva zobrazovanie „aktinickej fluorescencie“. Ak je zvolená vlnová dĺžka excitácie v blízkej ultrafialovej oblasti (320-400nm), ktorá je voľným okom neviditeľná, emisné spektrum fluorescencie je tiež kratšie ako priemerná vlnová dĺžka bežných svetelných zrkadlových svetelných zdrojov. zlepšiť. Vysokoenergetické fotóny sa zrážajú s elektrónmi, čo spôsobuje prechod elektrónov zo základného do excitovaného stavu. Elektróny v excitovanom stave sú veľmi nestabilné a spadnú späť do základného stavu. Pri tomto procese sa spotrebuje časť tepelnej energie a vyžiaria sa nové fotóny. Nový fotón má nižšiu energiu ako pôvodný fotón, a preto má dlhšiu vlnovú dĺžku. Keďže nová vlnová dĺžka fotónu je odlišná od vlnovej dĺžky fotónu dopadajúceho svetla, dva lúče svetla s rôznymi vlnovými dĺžkami sú oddelené určitým spôsobom optického spracovania, takže vidíme len emitované nové fotóny (fluorescenčný signál), tj. fluorescenčný mikroskop vidí fluorescenčné obrázky.
