Ako si vybrať vhodný fluorescenčný mikroskop
Fluorescenčný mikroskop je štandardné mikroskopické zobrazovacie zariadenie v laboratóriách a patologických oddeleniach, ktoré využíva fluorescenčné charakteristiky na pozorovanie a zobrazovanie. Je široko používaný v rôznych oblastiach, ako je bunková biológia, neurobiológia, botanika, mikrobiológia, patológia, genetika atď. Fluorescenčné zobrazovanie má výhody vysokej citlivosti a špecifickosti, vďaka čomu je veľmi vhodné na pozorovanie distribúcie špecifických proteínov, organel atď. v tkanivách a bunkách, študovanie spoločnej lokalizácie a interakcií, sledovanie životných dynamických procesov, ako sú zmeny koncentrácie iónov atď.
Výber mikroskopov
Fluorescenčné mikroskopy sa delia hlavne do troch kategórií: vertikálne fluorescenčné mikroskopy (vhodné na krájanie), inverzné fluorescenčné mikroskopy (vhodné pre živé bunky aj na krájanie) a stereo fluorescenčné mikroskopy (vhodné pre väčšie preparáty, ako sú rastliny, zebričky (dospelé/ embryonálne), medaka, orgány myší/potkanov atď.).
Výber fluorescenčných filtračných blokov
Pri výbere filtračných blokov by sa nemali brať do úvahy len vlnové dĺžky excitácie a emisie fluorescenčných sond, ale tiež by sa malo zvážiť, či existuje nešpecifická excitácia a či existuje farebné presluchy pre viacfarebne označené vzorky. V experimente zvolíme vlnovú dĺžku čo najbližšie k excitačnému vrcholu pre excitáciu a rozsah príjmu by mal zahŕňať vrchol emisie. Excitačný vrchol Alexa Fluor 488 je 500 nm a excitačný filter 480/40 je možné zvoliť vo fluorescenčnom mikroskope. Bežne používané fluorescenčné filtračné bloky vo fluorescenčnej mikroskopii možno rozdeliť do dvoch typov: dlhý priechod (LP) a pásmový priechod (BP), ktoré je tiež potrebné vybrať podľa potrieb.
Konfokálny mikroskop
Pri tradičných pozorovaniach fluorescenčnou mikroskopiou sú kvôli prekrývaniu fluorescenčne značených látok a spontánnych fluorescenčných štruktúr navzájom pevne spojené. Tradičné objektívy padajúcej fluorescenčnej mikroskopie však nielen zbierajú svetlo z ohniskovej roviny, ale aj rozptyľujú svetlo hore a dole po ohniskovej rovine, čo vedie k výraznému zníženiu rozlíšenia a kontrastu obrazu.
Konfokálne zobrazovanie deteguje iba svetlo odrazené od roviny automatického zaostrovania, čím rieši vyššie uvedený problém. Svetelný zdroj vytvára malý a jemný bod na ohniskovej rovine cez dierku a svetlo vyžarované z ohniskovej roviny sa zbiera cez šošovku objektívu. Väčšina fluorescencie vyžarovanej z bodov nad alebo pod ohniskovou rovinou šošovky objektívu nemôže konvergovať k dierke. Cez dierku môže prechádzať iba fluorescencia umiestnená v ohniskovej rovine a malá časť rozostrenej fluorescencie, zatiaľ čo svetelný lúč mimo ohniskovej roviny sa zbieha pred alebo za dierkovou doskou a je zablokovaný pred vstupom do detektora cez dierkovú dierku. Rozpoznaný obraz je z ohniskovej roviny, takže výsledná kvalita obrazu sa výrazne zlepší.
Vďaka rôznym výhodám a praktickosti laserovej skenovacej konfokálnej mikroskopie je v súčasnosti nepostrádateľným experimentálnym asistentom v oblasti vysoko presnej bunkovej biológie, botaniky a bunkového výskumu. Zároveň bude v budúcich vedecko-výskumných centrách najzákladnejším a kľúčovým výskumným nástrojom.
