Vylepšené výhody laserových skenovacích multifotónových mikroskopov
Laserový rastrovací multifotónový mikroskop je významným vylepšením optickej mikroskopie, ktorá sa prejavuje najmä v schopnosti pozorovať hlboké štruktúry živých buniek, fixovaných buniek a tkanív a získať jasné a ostré viac{0}}vrstvové Z{1}}rovinné štruktúry, konkrétne optické rezy, ktoré možno použiť na konštrukciu trojrozmerných pevných štruktúr vzoriek. Konfokálny mikroskop využíva zdroj laserového svetla, ktorý je rozšírený tak, aby vyplnil celú ohniskovú rovinu šošovky objektívu, a potom sa zbieha do veľmi malých bodov v ohniskovej rovine preparátu cez systém šošoviek šošovky objektívu. Podľa numerickej apertúry šošovky objektívu je priemer najjasnejšieho bodu osvetlenia približne 0,25-0,8 μm a hĺbka je približne 0,5-1,5 μm. Veľkosť konfokálneho bodu je určená konštrukciou mikroskopu, vlnovou dĺžkou lasera, charakteristikami objektívu, nastavením stavu skenovacej jednotky a vlastnosťami vzorky. Rozsah a hĺbka osvetlenia mikroskopu sú veľké, zatiaľ čo osvetlenie konfokálneho mikroskopu je zaostrené na ohnisko v ohniskovej rovine. Základnou výhodou konfokálnej mikroskopie je, že dokáže vykonávať jemné optické rezy na hrubých fluorescenčných vzorkách (do 50 μm alebo viac), s hrúbkou približne 0,5 až 1,5 μm. Séria obrazov optických rezov sa dá získať pohybom preparátu nahor a nadol pomocou krokového motora mikroskopu v osi Z-. Zber obrazových informácií je riadený v rovine * * bez rušenia signálmi vysielanými z iných pozícií na vzorke. Po odstránení vplyvu fluorescencie pozadia a zvýšení pomeru signálu k šumu sa kontrast a rozlíšenie konfokálnych obrazov výrazne zlepšili v porovnaní s tradičnými fluorescenčnými obrázkami osvetlenia poľa. V mnohých vzorkách sa zložité štrukturálne komponenty prelínajú a vytvárajú zložité systémy, ale akonáhle sa podarí zozbierať dostatok optických rezov, môžeme použiť softvér na ich rekonštrukciu v troch rozmeroch. Táto experimentálna metóda bola široko používaná v biologickom výskume na objasnenie zložitých štruktúrnych a funkčných vzťahov medzi bunkami alebo tkanivami.
