Úvod do fluorescenčnej mikroskopie
Fluorescenčná mikroskopia spočíva v ožiarení objektu zafarbeného fluoresceínom svetlom s krátkou vlnovou dĺžkou tak, že sa excituje, aby sa vytvorila fluorescencia s dlhou vlnovou dĺžkou, a potom sa pozoruje. Vo fluorescenčnom mikroskope musí byť excitačné svetlo špecifickej vlnovej dĺžky vybrané z osvetľovacieho svetla vzorky, aby sa vytvorila fluorescencia, a potom musí byť fluorescencia oddelená od zmiešaného svetla excitačného svetla a fluorescencie na pozorovanie. Preto zohráva filtračný systém mimoriadne dôležitú úlohu pri výbere konkrétnej vlnovej dĺžky. Fluorescenčné mikroskopy sú široko používané v biológii, medicíne a iných oblastiach.
1. Hlavné komponenty fluorescenčného mikroskopu:
(A) Svetelný zdroj: Svetelný zdroj vyžaruje svetlo rôznych vlnových dĺžok (od ultrafialového po infračervené). a
(B) Zdroj svetla s excitačným filtrom: prostredníctvom svetla so špecifickou vlnovou dĺžkou, ktorá môže spôsobiť, že vzorka vytvorí fluorescenciu, pričom blokuje svetlo, ktoré je zbytočné na vzrušujúcu fluorescenciu. a
(C) Fluorescenčné vzorky: vo všeobecnosti zafarbené fluorescenčnými pigmentmi. a
(D) Blokovací filter: blokuje excitačné svetlo, ktoré nie je absorbované vzorkou a selektívne prepúšťa fluorescenciu a niektoré vlnové dĺžky sa selektívne prenášajú vo fluorescencii.
a
2. Klasifikácia fluorescenčných mikroskopov:
Fluorescenčné mikroskopy sa vo všeobecnosti delia na dva typy: transmisné a epiemisné:
a. Typ prenosu: excitačné svetlo prichádza zo spodnej časti objektu, ktorý sa má kontrolovať, a kondenzor je kondenzor tmavého poľa, takže excitačné svetlo nevstupuje do šošovky objektívu, ale fluorescencia vstupuje do šošovky objektívu. Pri malom zväčšení je jasný, pri veľkom zväčšení tmavý. Je ťažké pracovať v olejovej imerzii a centrovaní. Je obzvlášť ťažké určiť rozsah osvetlenia pri malých zväčšeniach, ale môže to mať veľmi tmavé pozadie zorného poľa. Typ prenosu sa nepoužíva pre nepriehľadné predmety. a
b. Epi-type: Typ prenosu je v súčasnosti takmer eliminovaný. Väčšina nových fluorescenčných mikroskopov je typu epi. Svetelný zdroj prichádza zhora nad predmetom, ktorý sa má kontrolovať, a v optickej dráhe je rozdeľovač lúčov, takže je vhodný pre priehľadné aj nepriehľadné predmety, ktoré sa majú kontrolovať. Keďže šošovka objektívu funguje ako kondenzorová šošovka, je nielen jednoduchá na obsluhu, ale môže tiež dosiahnuť rovnomerné osvetlenie celého zorného poľa od malého zväčšenia až po veľké zväčšenie. a
a
3. Bezpečnostné opatrenia pre fluoroskopiu
a. Dlhodobé ožarovanie excitačného svetla spôsobí zoslabenie a zhášanie fluorescencie, preto čo najviac skráťte čas pozorovania a pri prechodnom nepozorovaní použite clonu na zakrytie excitačného svetla. a
b. Pri pozorovaní olejovou imerznou šošovkou používajte „nefluorescenčný olej“. a
c. Fluorescencia je takmer vždy slabá a mala by sa vykonávať v tmavej miestnosti. a
d. Najlepšie je nainštalovať stabilizátor napätia do napájacieho zdroja, inak nestabilné napätie nielen zníži životnosť ortuťovej výbojky, ale ovplyvní aj účinok kontroly mikroskopom. a
a
4. Použitie fluorescenčnej mikroskopie
1. Požiadavky na prípravu vzoriek fluorescenčného mikroskopu
a. Sklenená sklíčka
Hrúbka podložného skla by mala byť medzi 0,8 až 1,2 mm. Príliš hrubé sklíčko na jednej strane pohltí viac svetla a na druhej strane sa excitačné svetlo nemôže sústrediť na preparát. Sklíčka musia byť hladké, rovnomernej hrúbky a bez zjavnej autofluorescencie. Niekedy sa používajú sklíčka z kremenného skla. a
b. Krycie sklo
Hrúbka krycieho skla je približne 0,17 mm, hladké. Na zosilnenie excitačného svetla možno použiť aj suché krycie sklo, čo je špeciálne krycie sklo potiahnuté niekoľkými vrstvami látok (napr. fluorid horečnatý), ktoré majú rôzne interferenčné účinky na svetlo rôznych vlnových dĺžok, čo môže spôsobiť fluorescencia prebieha hladko. Budiace svetlo prechádza a odrazené excitačné svetlo excituje vzorku. a
c. Vzorka
Plátky tkaniva alebo iné vzorky by nemali byť príliš hrubé. Ak je príliš hrubá, väčšina excitačného svetla sa spotrebuje v spodnej časti preparátu, zatiaľ čo horná časť priamo pozorovaná šošovkou objektívu nemôže byť úplne excitovaná. Okrem toho sa bunky prekrývajú alebo nečistoty zakrývajú, čo ovplyvňuje úsudok. a
d. Montážny prostriedok
Glycerín sa bežne používa ako upevňovacie činidlo, ktoré nesmie mať žiadnu autofluorescenciu, musí byť bezfarebné a priehľadné a jas fluorescencie je jasnejší pri pH 8.5-9.5 a nie je ľahké rýchlo vyblednúť. Preto sa ako upevňovacie činidlo bežne používa rovnaká zmes glycerolu a 0,5 mol/l uhličitanového tlmivého roztoku s pH 9.{6}} až 9,5. a
e. zrkadlový olej
Pri pozorovaní vzoriek pomocou fluorescenčných mikroskopov v tmavom poli a imerzných objektívov s olejovou imerziou sa vo všeobecnosti musí použiť imerzný olej. Najlepšie je použiť špeciálny nefluorescenčný zrkadlový olej, ktorý možno nahradiť aj spomínaným glycerínom a možno použiť aj tekutý parafín, no index lomu je nízky, čo mierne ovplyvňuje kvalitu obrazu.
