Znalosti o konfokálnej fluorescenčnej mikroskopii
Základný princíp konfokálnej fluorescenčnej mikroskopie: na ožiarenie preparátu sa používa bodový svetelný zdroj a na ohniskovej rovine sa vytvorí dobre definovaný malý svetelný bod. zložené zo štiepačiek. Rozdeľovač lúčov posiela fluorescenciu priamo do detektora. Pred svetelným zdrojom a detektorom je dierka, ktorá sa nazýva iluminačná dierka a detekčná dierka. Geometrická veľkosť oboch je rovnaká, približne 100-200nm; vzhľadom na svetelnú škvrnu na ohniskovej rovine sú tieto dve konjugované, to znamená, že svetelná škvrna prechádza sériou šošoviek a nakoniec môže byť súčasne zaostrená na osvetľovaciu dierku a detekčnú dierku. Týmto spôsobom môže byť svetlo z ohniskovej roviny konvergované v rámci detekčného otvoru, zatiaľ čo rozptýlené svetlo zhora alebo pod ohniskovou rovinou je blokované mimo detekčného otvoru a nemožno ho zobraziť. Laser skenuje vzorku bod po bode a trubica fotonásobiča po detekcii dierky získa aj konfokálny obraz zodpovedajúceho svetelného bodu bod po bode, ktorý sa prevedie na digitálny signál a prenesie do počítača a nakoniec sa agreguje do čistého konfokálny obraz celej ohniskovej roviny na obrazovke .
Každý obraz ohniskovej roviny je vlastne optickým prierezom vzorky a tento optický prierez má vždy určitú hrúbku, tiež známu ako optický tenký rez. Keďže intenzita svetla v ohniskovom bode je oveľa väčšia ako v nezaostrovacom bode a svetlo neohniskovej roviny je filtrované dierkou, hĺbka poľa konfokálneho systému je približne nulová a skenovanie pozdĺž Z -axis môže realizovať optickú tomografiu, tvoriac Pozorujte dvojrozmerný optický rez na zaostrenom mieste vzorky. Kombináciou skenovania v rovine XY (ohnisková rovina) so skenovaním na osi Z (optická os) je možné získať trojrozmerný obraz vzorky akumuláciou dvojrozmerných obrazov súvislých vrstiev a spracovať pomocou špeciálneho počítačového softvéru.
