Znalosti o dvoj{0}}fotónovej fluorescenčnej mikroskopii
Základným princípom excitácie dvoch-fotónov je, že pri vysokej hustote fotónov môžu fluorescenčné molekuly súčasne absorbovať dva fotóny s dlhou vlnovou dĺžkou a po krátkom období života v takzvanom-excitovanom stave emitovať fotón s kratšou vlnovou dĺžkou; Účinok je rovnaký ako pri použití fotónu s polovičnou vlnovou dĺžkou dlhej vlnovej dĺžky na excitáciu fluorescenčných molekúl. Dvojfotónová excitácia vyžaduje vysokú hustotu fotónov, a aby sa predišlo poškodeniu buniek, dvoj{3}}fotónová mikroskopia používa vysoko{4}}energetický-režim uzamknutých pulzných laserov. Laser vyžarovaný týmto laserom má vysokú špičkovú energiu a nízku priemernú energiu so šírkou impulzu iba 100 femtosekúnd a frekvenciou až 80 až 100 megahertzov. Pri použití objektívu s vysokou numerickou apertúrou na zaostrenie fotónov pulzného lasera je hustota fotónov v ohnisku šošovky objektívu najvyššia a k excitácii dvoch fotónov dochádza iba v ohnisku šošovky objektívu. Dvoj{13}}fotónový mikroskop preto nevyžaduje konfokálnu dierku, čo zlepšuje účinnosť detekcie fluorescencie.
Vo všeobecnom fenoméne fluorescencie v dôsledku nízkej hustoty fotónov excitačného svetla môže fluorescenčná molekula absorbovať naraz iba jeden fotón a potom emitovať ďalší fluorescenčný fotón prostredníctvom radiačného prechodu, ktorý je známy ako fluorescencia jedného fotónu. Pri fluorescenčných excitačných procesoch využívajúcich lasery ako svetelné zdroje sa môžu vyskytnúť dvojfotónové alebo dokonca viacfotónové fluorescenčné javy. V tomto prípade má použitý zdroj excitačného svetla vysokú intenzitu a hustotu fotónov, ktorá spĺňa požiadavku, aby fluorescenčné molekuly absorbovali dva fotóny súčasne. V procese použitia všeobecného lasera ako zdroja excitačného svetla je hustota fotónov stále nedostatočná na vytvorenie fenoménu absorpcie dvoch fotónov. Typicky sa používajú femtosekundové pulzné lasery, ktorých okamžitý výkon dosahuje úroveň megawattov. Vlnová dĺžka fluorescencie dvoch fotónov je preto kratšia ako vlnová dĺžka excitačného svetla, čo zodpovedá efektu vyvolanému excitáciou polovičnej excitačnej vlnovej dĺžky.
