Metódy rozšírenia ohniskovej hĺbky multifotónových mikroskopov
Kombinácia dvoj{0}}fotónového laserového skenovacieho mikroskopu a vápnikového indikátora je zlatým štandardom pre detekciu neurónového signálu in vivo. Neuróny v neurónových sieťach sú rozmiestnené v trojrozmernom priestore a monitorovanie dynamiky ich aktivity si vyžaduje spôsob, ako rýchlo zlepšiť mieru objemového zobrazovania. Avšak pri použití mriežkového skenovacieho multifotónového mikroskopu na zobrazenie veľkého počtu obrázkov, ak sa použije objektív s vysokou numerickou apertúrou (NA) na dosiahnutie vyššieho laterálneho rozlíšenia, výsledkom bude menšia hĺbka ohniska. Aby ste získali objemové zobrazenie pri malej hĺbke ohniska,
Skenovanie osi Z{0}} je potrebné vykonať pomocou niektorých prostriedkov, pričom je potrebné zobraziť mnoho rovín skenovaním každej ohniskovej roviny, čo značne obmedzuje rýchlosť zobrazovania. Ak je možné obetovať axiálne obrazové informácie a objemové skenovanie je možné dosiahnuť v jednom laterálnom skenovaní rozšírením hĺbky zaostrenia, to znamená, že objemové informácie sa premietajú na jeden 2D obraz, rýchlosť zobrazovania sa môže výrazne zlepšiť. Toto sa nazýva zobrazovanie s rozšírenou hĺbkou zaostrenia (EDF), ktoré je užitočné najmä na zobrazovanie riedkych populačných štruktúr, ktoré vyžadujú vysoké časové rozlíšenie, ako je napríklad funkčné zobrazovanie neuronálnej aktivity.
Axiálne a laterálne rozlíšenie mikroskopu je určené numerickou apertúrou (NA) šošovky objektívu. Vysoká NA môže maximalizovať axiálne a laterálne rozlíšenie, ako aj množstvo zhromaždeného svetla; Nižšia NA povedie k nižšiemu axiálnemu rozlíšeniu, teda väčšej hĺbke ostrosti, no zároveň obetuje laterálne rozlíšenie a účinnosť zberu svetla. Metóda rozšírenia hĺbky ostrosti, ktorá bude predstavená ďalej, to môže dosiahnuť pri zachovaní vysokého bočného rozlíšenia a dostatočného svetelného toku.
Použitie priestorových modulátorov svetla na generovanie ohniskových štíhlych Besselových lúčov môže dosiahnuť EDF zobrazenie, ale modulátory priestorového svetla sú objemné a ťažko sa dajú zlúčiť s úzkymi priestormi mikroskopov; Naproti tomu Besselove moduly založené na axiálnych pyramídach sú lacné a kompaktné, ale dokážu generovať len ohniská s pevnou hĺbkou a nie sú vhodné na rôzne experimenty, ktoré si vyžadujú neustále zmeny ohniskovej hĺbky. Na vyriešenie tohto problému v roku 2018 RONGWEN LU a kol. demonštrovali Besselov modul založený na axikóne, v ktorom je potrebné preložiť len jednu šošovku pozdĺž optickej osi, aby sa plynulo upravovala axiálna dĺžka Besselovho ohniska.
Obrázok 1 (a) Schéma zariadenia Besselovho modulu; (b) Funkcia rozpätia bodu bola experimentálne meraná, keď D bolo -12 mm, 0 mm a 12 mm, v tomto poradí; (c) Vzťah medzi laterálnou plnou šírkou v polovici maxima, (d) axiálnou plnou šírkou v polovici maxima, (e) špičkovým signálom a (f) optickou mohutnosťou za šošovkou objektívu s posunom L2 D
Modulové zariadenie na vytvorenie Besselovho ohniska s premenlivou dĺžkou je znázornené na obrázku 1a. Dopadajúci Gaussov lúč je po prechode axikónou a šošovkou L1 tvarovaný do kruhového lúča. Následná maska s kruhovou apertúrou môže blokovať rozptýlené svetlo spôsobené axikónickými defektmi, čím formuje axiálnu distribúciu funkcie rozšírenia dvoch -fotónových excitačných bodov. Potom je svetelný lúč premietaný na galvanometer šošovkami L2 a L3 a potom dosiahne zadnú ohniskovú rovinu šošovky objektívu cez šošovky L4 a L5.
Tieto konštrukcie sú podobné tradičným modulom na báze pyramídy, s tým rozdielom, že pohybom L2 alebo L3 pozdĺž optickej osi možno plynule nastavovať axiálnu dĺžku Besselovho ohniska. Obrázok 1b znázorňuje funkcie axiálneho rozloženia bodu pre hodnoty D -12 mm, 0 mm a 12 mm, s axiálnou plnou šírkou v polovičnom maxime 39? m, 24? M a 14? m. Ako je znázornené na obrázku 1c-f, pohybom šošovky L2 zľava doprava sa môže plynule meniť celá šírka v polovičnom maxime v priečnom aj axiálnom smere, čo znamená, že hĺbku zaostrenia možno plynulo meniť. Výsledky numerickej simulácie založené na teórii vektorovej difrakcie sú v dobrej zhode s experimentálnymi údajmi. Obrázok 2 overuje korekčný účinok rôznych veľkostí prstencových masiek na axikónové defekty. Zistilo sa, že tenšie prstencové masky môžu lepšie optimalizovať distribúciu axiálnej intenzity výstupného Besselovho lúča, ale zároveň vedú aj k väčšej strate výkonu.
