Mikrobiologické mikroskopické priame počítanie
Experimentálny princíp
Priame počítanie pod mikroskopom pomocou hemocytometra je bežne používaná metóda počítania mikroorganizmov. Výhodou tejto metódy je, že je intuitívna a rýchla. Vhodne zriedenú bakteriálnu suspenziu (alebo suspenziu spór) vložte do počítacej komôrky medzi sklíčko a krycie sklo hemocytometra a počítajte pod mikroskopom. Keďže objem počítacej komôrky je pevný (0.1 mm2), možno ho previesť na celkový počet mikroorganizmov na jednotku objemu podľa počtu mikroorganizmov pozorovaných pod mikroskopom. Pretože táto metóda počíta súčet živých a mŕtvych baktérií, nazýva sa aj metóda celkového počtu baktérií.
Hemocytometer je zvyčajne špeciálne sklenené sklíčko, na ktorom štyri drážky tvoria tri plošiny. Plošina v strede je rozdelená na dve polovice krátkou horizontálnou drážkou. Na platforme je na každej strane vyrytá mriežka. Každá mriežka je rozdelená na deväť veľkých štvorcov. Veľký štvorec v strede je počítacia miestnosť. Mikroorganizmy sa počítajú v počítacej komore.
Mierka počítacej miestnosti má vo všeobecnosti dve špecifikácie, jedna je taká, že veľký štvorec je rozdelený na 16 stredných štvorcov a každý stredný štvorec je rozdelený na 25 malých štvorcov (obrázok Ⅷ-2); druhý je veľký štvorec Štvorec je rozdelený na 25 stredných štvorcov a každý stredný štvorec je rozdelený na 16 malých štvorcov (obrázok Ⅷ-1, C). Ale bez ohľadu na typ počítacej dosky, počet malých štvorcov v každom veľkom štvorci je rovnaký, teda 16×25=400 malých štvorcov.
Dĺžka strany každého veľkého štvorca je 1 mm a plocha každého veľkého štvorca je 1 mm2. Po zakrytí krycieho skla je výška medzi podložným sklíčkom a krycím sklom 0.1 mm, takže objem počítacej komory je 0.1 mm3.
Pri počítaní zvyčajne spočítajte celkový počet baktérií v piatich stredných štvorcoch, potom získajte priemernú hodnotu každého stredného štvorca a potom vynásobte 16 alebo 25, aby ste získali celkový počet baktérií vo veľkom štvorci, a potom preveďte na celkový počet baktérií v 1 ml bakteriálneho roztoku.
Laboratórne vybavenie
Hemocytometer, mikroskop, krycie sklíčko, sterilná kapilára;
Experimentálne materiály
Suspenzia Saccharomyces cerevisiae
Experimentálny postup (metóda priameho počítania mikrobiálneho mikroskopu)
1. riedenie
Riadne rozrieďte suspenziu Saccharomyces cerevisiae. Ak bakteriálny roztok nie je hustý, nie je potrebné ho riediť.
2. Mikroskopická počítacia miestnosť
Pred pridaním vzoriek vykonajte mikroskopickú kontrolu počítacej komory počítacej dosky. Ak sú nečistoty, je potrebné ich pred počítaním vyčistiť.
3. pridajte vzorku
Čistú a suchú hemocytometrickú doštičku prikryte krycím sklom a potom pomocou sterilného kvapkadla s úzkymi ústami kvapnite malú kvapku zriedeného roztoku Saccharomyces cerevisiae z okraja krycieho skla (nie príliš veľa), aby sa roztok baktérií je blízko medzery pozdĺž medzery. Kapilárna osmóza vstupuje do počítacej komory sama a všeobecná počítacia komora môže byť naplnená bakteriálnou kvapalinou. Dávajte pozor, aby ste nemali vzduchové bubliny.
4. mikroskopický počet
Po 5 minútach odpočinku umiestnite hemocytometer na stolík mikroskopu, najskôr pomocou nízkovýkonnej šošovky nájdite umiestnenie počítacej komôrky a potom prepnite na vysokovýkonnú šošovku na počítanie. Ak sa pred počítaním zistí, že bakteriálny roztok je príliš hustý alebo príliš riedky, je potrebné pred počítaním znovu upraviť riedenie. Všeobecné riedenie vzorky vyžaduje cca
5-10 buniek je vhodných. Každá počítacia komora vyberie baktérie v 5 stredných mriežkach (voliteľné 4 rohové a stredové mriežky) na počítanie. Baktérie na čiare mriežky sa vo všeobecnosti počítajú iba na hornej a pravej čiare. V prípade pučania kvasiniek, keď veľkosť tela púčika dosahuje polovicu materskej bunky, napočítajte dve baktérie. Spočítajte vzorku, aby ste vypočítali obsah baktérií vo vzorke z hodnôt napočítaných v dvoch počítacích komorách.
5. Čistenie hemocytometra
Po použití opláchnite doštičku na počítanie krviniek na kohútiku prúdom vody, neumývajte ju tvrdými predmetmi a po umytí ju osušte sami alebo fénom. Mikroskopické vyšetrenie, pozorujte, či sú v každej bunke zvyškové baktérie alebo iné usadeniny. Ak nie je čistý, treba ho opakovane umývať, kým nebude čistý.
