Učebňa mikroskopického zobrazovania丨Aplikácia fluorescenčnej mikroskopie
Totálna vnútorná reflexná fluorescenčná mikroskopia (TIRFM) je technika, ktorá využíva evanescenčnú vlnu generovanú svetelným lúčom šíriacim sa medzi dvoma rôznymi médiami s indexom lomu na sondovanie povrchu fluorescenčne označených živých buniek. V praxi, keď dopadajúci laserový lúč narazí na rozhranie medzi krycím sklíčkom a vodným médiom obsahujúcim bunky, odrazí sa pod kritickým uhlom (celkový vnútorný odraz). Pretože energia evanescentnej vlny klesá exponenciálne so vzdialenosťou od krycieho sklíčka, len fluorofóry do 10 nanometrov od povrchu (medzi 10 a 200 nanometrami) sú excitované evanescenčnou vlnou, zatiaľ čo fluorofóry ďalej sú z veľkej časti neexcitované. Ovplyvnené. Výsledkom TIRFM sú teda vysoké úrovne signálu z fluorofórov umiestnených v blízkosti krycieho sklíčka, ktoré sú prekryté na veľmi tmavom pozadí, čo poskytuje vynikajúci pomer signálu k šumu. Extrémne obmedzenie hĺbky excitácie je ideálne na štúdium jednotlivých molekúl alebo zloženia membrán a organel v adherentných bunkách blízko povrchu krycieho sklíčka (pozri obrázok 8(e)). Pretože excitácia je obmedzená na tenké oblasti v blízkosti krycieho sklíčka, fotobielenie a fototoxicita sú tiež obmedzené na tieto oblasti, čo robí TIRFM jednou z najužitočnejších metód na dlhodobé pozorovanie. Táto technika sa stala základným nástrojom na štúdium širokého spektra javov v bunkovej a molekulárnej biológii.
Dekonvolúcia je algoritmus aplikovaný na súbor obrazov so všetkými ohniskami získanými pozdĺž optickej osi (Z) na zlepšenie fotónového signálu v hromade obrazov pre danú obrazovú rovinu alebo viacero ohniskových rovín. Mikroskopy musia byť vybavené vysoko presnými motorizovanými zaostrovacími pohonmi, aby sa zaručilo získavanie obrazu v presne definovaných intervaloch medzi ohniskovými rovinami vzorky. V typickej aplikácii (pozri obr. 8(f)) sa proces dekonvolúcie používa na rozmazanie a odstránenie rozostreného svetla z danej ohniskovej roviny pomocou excitácie a emisie fluorescencie so širokým poľom. Najkomplexnejšou aplikáciou je aplikovať proces dekonvolúcie na celý zásobník obrázkov na generovanie premietaných pohľadov alebo 3D modelov. Súbor širokouhlých obrazov používaných na dekonvolúciu zachytáva teoretický maximálny počet fotónov emitovaných vzorkou. Proces dekonvolúcie prerozdeľuje „rozmazané“ intenzity fotónov emitovaných nad a pod ohniskovou rovinou späť do pôvodnej roviny. Dekonvolúcia teda využíva takmer všetky dostupné intenzity emisií a poskytuje optimálny svetelný rozpočet, vďaka čomu je táto technika metódou voľby pre vzorky veľmi citlivé na svetlo.
Na získanie kvantitatívnych časových a priestorových informácií o väzbe a interakcii proteínov, lipidov, enzýmov a nukleových kyselín v živých bunkách sa používa variant fenoménu prenosu rezonančnej energie vo fluorescenčnej mikroskopii, fluorescencii alebo Försterovom rezonančnom prenose energie (FRET). FRET môže využívať buď techniky v konštantnom stave alebo časovo rozlíšené techniky, ale časovo rozlíšené FRET zobrazovanie má výhodu presnejšieho mapovania vzdialeností darcu a akceptora. Na FRET zobrazovanie je možné použiť štandardný širokouhlý fluorescenčný mikroskop vybavený príslušnými excitačnými a emisnými filtrami a citlivou kamerou. Biosenzory, ktoré vkladajú environmentálne citlivý proteín alebo peptid medzi dva fluorescenčné proteíny použiteľné FRET, sú v súčasnosti široko používané v bunkovej biológii. Tieto sondy sa dajú ľahko zobraziť pod fluorescenčnou mikroskopiou so širokým poľom s použitím techník senzibilizovanej emisie FRET v kombinácii s pomerovou analýzou. Okrem toho spektrálne zobrazovanie a lineárne rozmiešanie pomocou laserovej skenovacej konfokálnej mikroskopie môže pomôcť monitorovať javy FRET v biosenzoroch a iných fluorescenčných proteínových aplikáciách.
Zobrazovacia mikroskopia s fluorescenčnou životnosťou (FLIM) je sofistikovaná technika schopná súčasne zaznamenávať životnosť fluorescencie a priestorové umiestnenie fluorofóru na každom mieste na obrázku. Táto metóda poskytuje mechanizmus na štúdium environmentálnych parametrov, ako je pH, iónová koncentrácia, polarita rozpúšťadla, nekovalentné interakcie, viskozita a napätie kyslíka v jednotlivých živých bunkách a prezentuje údaje v priestorových a časových poliach. FLIM merania životnosti excitovaného stavu na nanosekundovej stupnici sú nezávislé od lokálnych koncentrácií fluorofórov, účinkov fotobielenia a dĺžky dráhy (hrúbka vzorky), ale sú citlivé na reakcie excitovaného stavu, ako je prenos rezonančnej energie. V skutočnosti sa kombinácia FLIM s FRET monitorovaním celoživotných zmien fluorescenčných darcov pred a po prenose rezonančnej energie považuje za jeden z najlepších spôsobov štúdia tohto javu.
Mobilita (koeficient priečnej difúzie) fluorescenčne značených makromolekúl a malých fluorofórov sa môže určiť technikou obnovenia fluorescencie po fotobielení (FRAP). Pri FRAP je veľmi malá vybraná oblasť (niekoľko mikrometrov v priemere) intenzívne osvetlená, zvyčajne laserom, aby došlo k úplnému odfarbeniu fluorofóru v tejto oblasti svetlom. Výsledkom je dramatické zníženie alebo zničenie fluorescencie. Po pulze odfarbenia svetlom sa rýchlosť a rozsah obnovy intenzity fluorescencie v odfarbených oblastiach monitorovali ako funkcia času pri nízkych intenzitách excitácie, aby sa získali informácie o kinetike opätovného osídlenia a regenerácie fluorofórov (obrázok 9). FRAP sa zvyčajne uskutočňuje pomocou EGFP alebo iných fluorescenčných proteínov. Súvisiace techniky fotoaktivácie sú založené na špeciálnych syntetických klietkových fluorofóroch alebo podobne funkčných fluorescenčných proteínoch, ktoré môžu byť aktivované krátkymi pulzmi UV alebo fialovej. Fotoaktivácia a FRAP sa môžu použiť ako doplnkové techniky na určenie parametrov mobility.
V technike súvisiacej s FRAP, nazývanej strata fluorescencie po fotobielení (FLIP), definovaná fluorescenčná oblasť v živej bunke podlieha opakovanému fotobieleniu intenzívnym ožiarením. Ak by všetky fluorofóry boli schopné difundovať do oblasti, ktorá sa bieli svetlom počas meraného časového obdobia, viedlo by to k úplnej strate fluorescenčného signálu v celej bunke. Výpočtom rýchlosti, ktorou fluorescencia mizne z celej bunky, možno určiť difúznu pohyblivosť cieľového fluorofóru. Okrem toho môže FLIP ľahko identifikovať umiestnenie a povahu akýchkoľvek difúznych bariér medzi jednotlivými kompartmentmi buniek, ako je bariéra medzi somom a axónom neurónu.
Fluorescenčná korelačná spektroskopia (FCS), používaná hlavne v laserovej skenovacej konfokálnej mikroskopii alebo multifotónovej mikroskopii, je metóda určená na určenie kinetických informácií, ako sú rýchlosti chemickej reakcie, difúzne koeficienty, techniky pre molekulovú hmotnosť, prietok a agregáciu. V FCS je malý objem (približne jeden femtometer; difrakčne obmedzené ohnisko lasera) osvetlený zaostreným laserovým lúčom, aby sa zaznamenali fluktuácie intenzity autofluorescencie vyvolané dynamikou fluorescenčných molekúl ako funkcia času v objeme obsadenom fluorescenčnou látkou. molekuly (obr. 10). Relatívne malé fluorofóry rýchlo difundujú v osvetlenom objeme a vytvárajú krátke záblesky náhodnej intenzity. Naopak, väčšie komplexy (fluorofóry naviazané na makromolekuly) sa pohybujú pomalšie a vytvárajú dlhšie, trvalejšie časovo závislé vzory intenzity fluorescencie.
Keď sú fluorescenčne označené štruktúry husto zbalené a prekrývajú sa v špecifických oblastiach živých buniek, je ťažké analyzovať ich dynamiku a priestorové rozloženie. Fluorescenčná bodová mikroskopia (FSM) je technika kompatibilná s takmer všetkými zobrazovacími modalitami, ktorá využíva veľmi nízke koncentrácie fluorescenčne značených podjednotiek, znižuje fluorescenciu mimo ohniska a zlepšuje viditeľnosť značených štruktúr a ich dynamiku v hrubých oblastiach. FSM sa implementujú označovaním len zlomku celej štruktúry záujmu. V tomto zmysle je FSM podobný vykonávaniu FCS v celom zornom poli, aj keď kladie väčší dôraz na priestorové vzory ako na kvantitatívnu časovú analýzu. Fluorescenčná bodová mikroskopia je obzvlášť užitočná pri určovaní mobility a agregácie cytoskeletálnych prvkov, ako je aktín a mikrotubuly v hyperaktívnych bunkách.
Mikroskopia so stimulovanou emisiou vyčerpania (STED) je novovznikajúca technika s vysokým rozlíšením s priestorovým rozlíšením ďaleko za hranicou difrakcie, ktorá využíva prstencovité ochudobnené svetlo na obklopenie menšieho lúča excitačného svetla na získanie sub-50 nm na osi uznesenie. Technika sa spolieha na excitáciu fluoroforov synchronizovanými laserovými impulzmi a priestorovo koordinovanými kruhovými impulzmi STED, ktoré vyčerpávajú emitované svetlo a potláčajú fluorescenciu excitovaných molekúl okolo laserového skenovacieho ohniska. Fluorescencia generovaná na okraji škvrny je potlačená, ale nie v strede škvrny, čím sa výrazne znižuje veľkosť fluorescenčnej škvrny a zodpovedajúcim spôsobom sa výrazne zvyšuje rozlíšenie. STED sa ukázal ako užitočný nástroj na detekciu živých buniek s vysokým rozlíšením. Iné vznikajúce techniky s vysokým rozlíšením, ako je fotoaktivovaná lokalizačná mikroskopia (PALM) a štruktúrovaná svetelná iluminačná mikroskopia (SIM), sa tiež stanú základnými nástrojmi pre zobrazovanie živých buniek v blízkej budúcnosti.
Rastúce používanie geneticky kódovaných fluorescenčných proteínov a pokročilých syntetických fluorofórov na zobrazovanie živých buniek otvára dvere novým optickým modalitám na monitorovanie časovej dynamiky a priestorových vzťahov. Mikroskopisti majú teraz k dispozícii kompletnú sadu nástrojov na pozorovanie a zaznamenávanie obrazových údajov bunkových procesov prebiehajúcich v širokom rozsahu časových rozsahov a vo viacerých rozlíšeniach. Pomalšie udalosti možno ľahko pozorovať a zaznamenávať pomocou laserovej skenovacej konfokálnej mikroskopie, zatiaľ čo rýchlejšie kinetické udalosti možno získať pomocou technológie rotujúceho disku. Okrem toho multifotónová mikroskopia umožňuje hĺbkové zobrazovanie v hrubých tkanivách a techniky úplného vnútorného odrazu umožňujú snímanie povrchov membrán s konfokálnou presnosťou. Pokročilé fluorescenčné metódy, ako sú FRET, FLIM, FRAP, FCS, FSM, SIM, PALM a STED, sa môžu použiť na monitorovanie interakcií proteín-proteín v rozlíšení, ktoré je často lepšie, ako umožňuje difrakčný limit. S pokrokom vo fluorofóre, mikroskope a technológii detektorov sa „pod mikroskop“ dostane širší svet.
