Zobrazovanie pomocou multifotónovej mikroskopie: rôzne techniky na zobrazovanie neurónov in vivo
V porovnaní s tradičným jednofotónovým fluorescenčným mikroskopom so širokým poľom má multifotónová mikroskopia (MPM) funkcie optického rezu a hlbokého zobrazovania. V roku 2019 Jerome Lecoq a spol. diskutovali o súvisiacej technológii MPM z troch aspektov: zobrazovanie neurónov hlboko v mozgu, masívne zobrazovanie neurónov a vysokorýchlostné zobrazovanie neurónov.
Aby bolo možné prepojiť aktivitu neurónov s komplexným správaním, je zvyčajne potrebné zobraziť neuróny v hlbokej kôre, čo vyžaduje, aby MPM mala schopnosť hĺbkového zobrazenia. Excitačné a emisné svetlo bude vysoko rozptýlené a absorbované biologickým tkanivom, čo je hlavný faktor obmedzujúci hĺbku zobrazenia MPM. Hoci problém rozptylu možno vyriešiť zvýšením intenzity lasera, prinesie to ďalšie problémy, ako je spálenie vzorky, rozostrenie a fluorescenčné budenie blízko povrchu. Najlepší spôsob, ako zväčšiť hĺbku zobrazenia MPM, je použiť dlhšie vlnové dĺžky ako excitačné svetlo.
Okrem toho, pre dvojfotónové (2P) zobrazovanie sú dva najväčšie faktory obmedzujúce hĺbku fluorescenčná excitácia rozostrená a blízko povrchu, zatiaľ čo pri trojfotónovom (3P) zobrazovaní sú tieto dva problémy výrazne znížené, ale trojfotónové zobrazovanie v dôsledku fluorescencie Absorpčný prierez skupiny je oveľa menší ako prierez 2P, takže na získanie fluorescenčného signálu rovnakej intenzity ako je excitovaný 2P je potrebná rádovo vyššia energia impulzu. Funkčná 3P mikroskopia je náročnejšia ako štrukturálna 3P mikroskopia, ktorá si vyžaduje rýchlejšie skenovanie, aby sa včas odobrala vzorka neuronálnej aktivity; vyššia energia impulzu je potrebná na zhromaždenie dostatočného množstva signálov počas doby zotrvania každého pixelu.
Komplexné správanie často zahŕňa veľké mozgové siete s lokálnymi aj diaľkovými spojeniami. Na prepojenie aktivity neurónov so správaním je potrebné súčasne sledovať aktivitu veľmi veľkých a široko distribuovaných neurónov. Neurónová sieť v mozgu spracováva prichádzajúce podnety v priebehu desiatok milisekúnd. Aby sme pochopili túto rýchlu neurónovú sieť Na štúdium dynamiky neurónov sa vyžaduje, aby MPM mala schopnosť rýchlo zobrazovať neuróny. Rýchle metódy MPM možno rozdeliť na techniky skenovania s jedným lúčom a techniky skenovania s viacerými lúčmi.
Technológia skenovania jedným lúčom umožňuje vysokorýchlostný prechod nervovým tkanivom s veľkým zorným poľom (FOV)
Pri použití MPM na zobrazenie neurónov môže skenovanie s náhodným prístupom – to znamená, že laserový lúč sa rýchlo naskenuje v akomkoľvek zvolenom bode v celom zornom poli – skenovať iba neuróny záujmu, čím sa nielenže vyhnete skenovaniu akýchkoľvek neoznačených nervových vlákien. tiež optimalizovať čas skenovania laserového lúča. Skenovanie s náhodným prístupom (obr. 1) je možné dosiahnuť pomocou akusticko-optického deflektora (AOD), ktorý funguje naviazaním piezoelektrického meniča s rádiofrekvenčným signálom na vhodný kryštál. Výsledné akustické vlny indukujú periodickú mriežku indexu lomu. K difrakcii dochádza, keď laserový lúč prechádza cez mriežku. Intenzitu a frekvenciu zvukovej vlny je možné upraviť pomocou vysokofrekvenčného elektrického signálu, aby sa zmenila intenzita a smer difraktovaného svetla, takže pomocou jedného AOD možno realizovať jednorozmerné horizontálne ľubovoľné bodové skenovanie a je možné realizovať 3D pomocou dvojice AOD kombinovaných s inými technológiami axiálneho skenovania skenovaním s náhodným prístupom. Táto technika je však veľmi citlivá na pohyb vzorky a náchylná na pohybové artefakty. V súčasnosti je široko používané rýchle rastrové skenovanie, teda progresívne skenovanie v FOV, pretože algoritmus dokáže ľahko vyriešiť pohybové artefakty.
Dvojfotónové zobrazovanie neokortikálnych neurónov L2/3 in vivo na báze AOD[2]
Existuje mnoho spôsobov, ako realizovať rýchle rastrové skenovanie, pomocou vibračného zrkadla pre rýchle 2D skenovanie, kombináciou vibračného zrkadla a nastaviteľnej elektrickej šošovky pre rýchle 3D skenovanie, ale nastaviteľná elektrická šošovka nedokáže rýchlo zaostriť v axiálnom smere kvôli obmedzeniu mechanická zotrvačnosť Prepínanie, ktoré ovplyvňuje rýchlosť zobrazovania, je teraz možné nahradiť modulátorom priestorového svetla (SLM).
Diaľkové zaostrovanie je tiež prostriedkom na dosiahnutie 3D zobrazenia, ako je znázornené na obrázku 2. V module LSU skenovací galvanometer skenuje horizontálne a modul ASU obsahuje šošovku objektívu L1 a zrkadlo M a axiálne skenovanie sa realizuje nastavením poloha M. Táto technika dokáže nielen korigovať optickú aberáciu spôsobenú šošovkou hlavného objektívu L2, ale umožňuje aj rýchle axiálne skenovanie. Ak chcete získať viac neurónového zobrazovania, FOV možno zväčšiť úpravou konštrukcie šošovky objektívu mikroskopu, ale šošovka objektívu s veľkou NA a veľkým FOV je zvyčajne ťažká a nemôže sa rýchlo pohybovať pre rýchle axiálne skenovanie, takže veľké systémy FOV sa spoliehajú na Telefocus. , SLM a nastaviteľné motorizované šošovky.
Schematický diagram vzdialeného zaostrovacieho dvojfotónového zobrazovacieho systému[3] Technológia viaclúčového skenovania dokáže súčasne zobraziť rôzne polohy neurónového tkaniva
This technique3 typically uses two independent paths for imaging two distant (>1-2 mm od seba) miesta zobrazenia (obr. 3C,D); pre priľahlé oblasti zvyčajne používa na zobrazenie viacero lúčov jednej šošovky objektívu (obr. 3E,F). Technika viaclúčového skenovania musí venovať osobitnú pozornosť problému presluchu medzi excitačnými lúčmi, ktorý možno vyriešiť metódou separácie zdroja svetla alebo metódou časopriestorového multiplexovania. Post-hoc metóda oddelenia svetelného zdroja sa týka použitia algoritmov na oddelenie lúčov, aby sa eliminovali presluchy; metóda časopriestorového multiplexovania sa týka súčasného použitia viacerých budiacich lúčov, impulzy každého lúča sú časovo oneskorené, takže jednotlivé lúče excitované rôznymi lúčmi môžu byť dočasne oddelené. fluorescenčný signál. Zavedením viacerých lúčov je možné zobraziť viac neurónov, ale viaceré lúče zvýšia prekrytie času rozpadu fluorescencie, čo obmedzuje schopnosť rozlíšiť zdroje signálu; a multiplexovanie má negatívny vplyv na pracovnú rýchlosť elektronických zariadení. Vysoké požiadavky; veľký počet lúčov tiež vyžaduje vyšší výkon lasera na udržanie približného pomeru signálu k šumu jedného lúča, čo môže ľahko viesť k poškodeniu tkaniva.
Technológia veľkoplošného zobrazovania
V posledných rokoch vývoj rôznych technológií MPM rozšíril rozsah nášho zobrazovania nervového tkaniva, čo nám umožnilo zobraziť viac neurónov hlboko v mozgu vyššou rýchlosťou, čo výrazne podporilo neurovedecký výskum a umožnilo nám získať jasnejšie pochopenie. funkcie mozgu.
