Technológia zobrazovania pomocou multifotónovej mikroskopie: polarizačná-rozlíšená druhá-mikroskopia harmonickej generácie a jej spracovanie obrazu
V nelineárnych optických mikroskopoch sa na pozorovanie endogénnych vláknitých štruktúr bežne používa zobrazovanie druhej harmonickej generácie (SHG) a intenzita SHG do značnej miery závisí od relatívneho uhla medzi smerom polarizácie dopadajúceho lúča a orientačnou osou cieľovej molekuly. Preto zobrazovanie SHG založené na polarizácii (P-SHG) môže získať štrukturálne informácie o cieľových molekulách analýzou funkčného vzťahu medzi intenzitou signálu SHG a stavom polarizácie dopadajúceho lúča. V súčasnosti sa používa ako dôležitý nástroj pre lekárske a biologické analýzy.
Jednoduché snímky SHG možno získať pomocou tradičnej dvoj{0}}fotónovej excitačnej fluorescenčnej mikroskopie (TPM). Väčšina systémov TPM stále používa metódu skenovania jedným lúčom založenú na pohyblivom zrkadle, ktorého časové rozlíšenie závisí od rýchlosti fyzického pohybu zrkadla. Aby sa dosiahlo rýchlejšie zobrazovanie, systém TPM môže tiež použiť metódu skenovania s viacerými lúčmi (obrázok 1A), z ktorých jednou je použitie rotačnej diskovej skenovacej jednotky. Táto jednotka sa skladá z koaxiálneho otočného taniera s mikrošošovkami a otočného taniera s dierkami, pričom mikrošošovky a dierky na každom otočnom tanieri zodpovedajú jednej -k- jednej.
Keď laser prechádza cez otočný tanier s mikrošošovkami, čelo vlny pokrýva viacero mikrošošoviek. Rôzne mikrošošovky zaostrujú rôzne časti čela vlny do rôznych polôh a prechádzajú cez zodpovedajúce dierky, čím vytvárajú viacero mikrolúčov. Tieto mikro lúče dopadajúce na vzorku môžu súčasne vybudiť viacero signálov. Tieto signály sa vracajú pozdĺž mikroskopického systému a znova prechádzajú dierkou a nakoniec sa odrazia dichroickým zrkadlom medzi dvoma otočnými taniermi do detekčného zariadenia. Bežne používaný titánový zafírový laser s uzamknutým režimom-ako zdroj svetla má však nedostatočnú energiu, čo obmedzuje počet excitačných lúčov a výsledkom je malé efektívne zorné pole (FOV) pre TPM (TPM-SD) pomocou rotačnej skenovacej jednotky.
Ai Goto a kol. cieľom bolo dosiahnuť vysoko-rýchlostné P-SHG zobrazovanie s veľkým zorným poľom (FOV) pomocou systému TPM-SD. Preto bol do systému TPM-SD zavedený laserový zdroj na báze Yb s vyšším špičkovým výkonom.
Toto je schematický diagram systému TPM-SD, ktorý vyvinuli. Svetelným zdrojom systému je laser na báze Yb, ktorý generuje femtosekundové impulzy so strednou vlnovou dĺžkou 1042 nm, priemerným výkonom 4 W, šírkou impulzu 300 fs a opakovacou frekvenciou 10 MHz. Systém najprv nastaví výkon lasera pomocou polvlnovej platne a laserového polarizátora Glan a potom rozšíri lúč cez expandér lúčov. Expandovaný lúč sa zavedie do otočnej skenovacej jednotky a viaceré mikrolúče vychádzajúce zo skenovacej jednotky sa zaostria na viaceré body vzorky cez šošovku objektívu ponoreného do vody. Aby sa nastavil stav polarizácie svetelného lúča na šošovke objektívu, na optickú dráhu excitačného lúča sú umiestnené polovičné a štvrťvlnové dosky.
