Princíp a aplikácia fluorescenčnej mikroskopie
(1) Princíp a štrukturálne charakteristiky fluorescenčného mikroskopu: fluorescenčný mikroskop využíva bodový svetelný zdroj s vysokou svetelnou účinnosťou na vyžarovanie svetla určitej vlnovej dĺžky (ako je ultrafialové svetlo 3650 palcov alebo fialové modré svetlo 4200 palcov) cez filtračný systém ako excitačné svetlo na excitáciu vzorky. Potom, čo fluorescenčná látka vo vnútri vyžaruje fluorescenciu rôznych farieb, je pozorovaná prostredníctvom zväčšenia šošovky objektívu a okuláru. Týmto spôsobom, pod silným kontrastným pozadím, aj keď je fluorescencia veľmi slabá, je ľahko identifikovateľná a má vysokú citlivosť. Používa sa najmä na výskum bunkovej štruktúry a funkcie a chemického zloženia. Základná konštrukcia fluorescenčného mikroskopu sa skladá z bežného optického mikroskopu plus niektorého príslušenstva (ako je zdroj fluorescenčného svetla, excitačný filter, dvojfarebný rozdeľovač lúčov a blokovací filter atď.). Fluorescenčný zdroj svetla - všeobecne sa používa ultravysokotlaková ortuťová výbojka (50-200W), ktorá môže vyžarovať svetlo rôznych vlnových dĺžok, ale každá fluorescenčná látka má excitačnú vlnovú dĺžku, ktorá produkuje najsilnejšiu fluorescenciu, preto je potrebné pridať excitačný filter ( Vo všeobecnosti existujú ultrafialové, fialové, modré a zelené excitačné filtre), ktoré prepúšťajú iba excitačné svetlo určitej vlnovej dĺžky a ožarujú vzorku, zatiaľ čo iné svetlo absorbujú. Každá látka po ožiarení excitačným svetlom vyžaruje vo veľmi krátkom čase viditeľnú fluorescenciu s väčšou vlnovou dĺžkou ako je vlnová dĺžka ožiarenia. Fluorescencia je špecifická a vo všeobecnosti slabšia ako excitačné svetlo. Aby bolo možné pozorovať špecifickú fluorescenciu, je potrebný blokovací (alebo potláčací) filter za šošovkou objektívu. Má dve funkcie: jednou je absorbovať a blokovať vstup excitačného svetla do okuláru, aby nedošlo k narušeniu fluorescencie a poškodeniu zraku; druhým je vybrať a nechať prejsť špecifickú fluorescenciu, pričom ukáže špecifickú fluorescenčnú farbu. Oba filtre sa musia používať spolu.
Existujú dva typy fluorescenčných mikroskopov z hľadiska ich optických dráh:
1. Transmisný fluorescenčný mikroskop: Zdroj excitačného svetla excituje fluorescenciu cez materiál vzorky cez kondenzorovú šošovku. Bežne sa používa kolektor tmavého poľa a bežný kolektor sa dá použiť aj na nastavenie zrkadla tak, aby sa excitačné svetlo prenášalo a obchádzalo do preparátu. Toto je staromódny fluorescenčný mikroskop. Výhodou je, že fluorescencia je silná pri malom zväčšení a nevýhodou je, že fluorescencia klesá so zvyšujúcim sa zväčšením. Preto je lepšie na pozorovanie väčších vzoriek materiálov.
2. Epi-fluorescenčný mikroskop Ide o nový typ fluorescenčného mikroskopu vyvinutý v modernej dobe. Rozdiel je v tom, že excitačné svetlo dopadá zo šošovky objektívu na povrch preparátu, to znamená, že rovnaká šošovka objektívu sa používa ako osvetľovací kondenzor a šošovka objektívu na zber fluorescencie. Dichroický rozdeľovač lúčov je potrebné pridať do svetelnej dráhy, ktorá je vzdialená 45 stupňov od ľahkého uránu. Budiace svetlo sa odráža do šošovky objektívu a zachytáva sa na vzorke. Fluorescencia generovaná vzorkou a excitačné svetlo odrazené povrchom šošovky šošovky objektívu a povrchom krycieho skla vstupujú do šošovky objektívu súčasne a vracajú sa do dvojfarebného rozdeľovača lúčov, aby sa excitačné svetlo oddelilo od fluorescencie , zvyškové excitačné svetlo je absorbované blokovacími filtrami. Ak prejdete na kombináciu rôznych excitačných filtrov/dvojfarebných rozdeľovačov lúčov/blokovacích filtrov, možno uspokojiť potreby rôznych produktov fluorescenčnej reakcie. Výhodou tohto typu fluorescenčného mikroskopu je, že osvetlenie zorného poľa je rovnomerné, zobrazenie je jasné a čím väčšie zväčšenie, tým silnejšia je fluorescencia.
(2) Ako používať fluorescenčný mikroskop.
1. Zapnite zdroj svetla, ultravysokotlaková ortuťová výbojka sa musí niekoľko minút zahriať, aby dosiahla najjasnejší bod.
2. Pre transmisný fluorescenčný mikroskop by mal byť medzi zdroj svetla a kondenzor nainštalovaný požadovaný excitačný filter a za šošovku objektívu by mal byť nainštalovaný zodpovedajúci blokovací filter. Epifluorescenčné mikroskopy potrebujú vložiť požadovaný excitačný filter/dvojfarebný rozdeľovač lúčov/blokovacie filtre do štrbín v dráhe svetla.
3. Pozorujte objektívom s malým zväčšením a upravte stred svetelného zdroja podľa nastavovacieho zariadenia rôznych typov fluorescenčných mikroskopov tak, aby sa nachádzal v strede celého osvetľovacieho bodu.
4. Umiestnite hárok so vzorkami a po zaostrení pozorujte. Pri používaní je potrebné venovať pozornosť: Nesledujte priamo koncový filter, aby ste nepoškodili zrak; pri pozorovaní preparátu olejovou šošovkou treba použiť špeciálnu olejovú šošovku bez fluorescencie; po vypnutí vysokotlakovej ortuťovej výbojky nie je možné ju ihneď znova zapnúť a je potrebné ju otestovať. Môže sa reštartovať po 5 minútach, inak bude nestabilná a ovplyvní životnosť ortuťovej výbojky.
(3) Pozorovanie Pomocou filtra modrofialového svetla pod fluorescenčným mikroskopom na vyučovacej platforme je možné vidieť, že bunky zafarbené fluorescenčným farbivom o, 01 percenta akridínovej oranžovej, jadro a cytoplazma sú excitované tak, aby produkovali dve rôzne farby fluorescencia (tmavá) zelená a oranžovo-červená).
