Princíp a konštrukcia fluorescenčného mikroskopu
Fluorescenčný mikroskop využíva bodový svetelný zdroj s vysokou svetelnou účinnosťou, ktorý vyžaruje určitú vlnovú dĺžku svetla (ako je ultrafialové svetlo 3650 palcov alebo fialové modré svetlo 4200 palcov) cez systém farebného filtrovania ako excitačné svetlo a excituje fluorescenčné látky vo vzorke. emitujú rôzne farby fluorescencie. Potom sa pozoruje prostredníctvom zväčšenia objektívu a okuláru. Týmto spôsobom, dokonca aj so slabou fluorescenciou, je ľahko rozpoznateľný a vysoko citlivý na silnom kontrastnom pozadí, používa sa hlavne na štúdium bunkovej štruktúry a funkcie, ako aj chemického zloženia. Základná konštrukcia fluorescenčného mikroskopu sa skladá z bežného optického mikroskopu a niektorých doplnkov (ako je zdroj fluorescenčného svetla, excitačný filter, separátor bichromatického lúča a blokovací filter atď.). Fluorescenčné zdroje svetla – zvyčajne používajú ultravysokotlakové ortuťové výbojky (50-200W), ktoré môžu vyžarovať svetlo rôznych vlnových dĺžok. Každá fluorescenčná látka má však vlnovú dĺžku excitačného svetla, ktorá produkuje najsilnejšiu fluorescenciu, takže je potrebné pridať excitačné filtre (zvyčajne ultrafialové, fialové, modré a zelené excitačné filtre), aby umožnili prechod a osvetlenie len určitej vlnovej dĺžky excitačného svetla. vzorku, pričom absorbuje všetko ostatné svetlo. Každá látka po ožiarení excitovaným svetlom vyžaruje vo veľmi krátkom čase viditeľnú fluorescenciu s dlhšou vlnovou dĺžkou ako je ožiarenie. Fluorescencia má špecifickosť a je vo všeobecnosti slabšia ako excitačné svetlo. Aby bolo možné pozorovať špecifickú fluorescenciu, je potrebné za šošovku objektívu pridať blokovací (alebo potláčajúci) filter. Má dve funkcie: po prvé, absorbuje a blokuje excitačné svetlo prenikať do okuláru, aby sa zabránilo rušeniu fluorescencie a poškodeniu očí; po druhé, vyberá a umožňuje prechod špecifickej fluorescencie, pričom zobrazuje špecifickú farbu fluorescencie. Obidva typy filtrov je potrebné zvoliť na spoločné použitie.
Existujú dva typy fluorescenčných mikroskopov na základe ich optickej dráhy:
1. Transmisný fluorescenčný mikroskop: Zdroj excitačného svetla prechádza cez materiál vzorky cez kondenzor, aby sa excitovala fluorescencia. Bežne používané kolektory svetla v tmavom poli alebo bežné kolektory svetla sa môžu použiť na nastavenie reflektora na premenu excitačného svetla a bočného svetla na vzorku. Ide o relatívne staromódny fluorescenčný mikroskop. Jeho výhodou je, že fluorescencia je silná pri malom zväčšení, naopak nevýhodou je, že fluorescencia s rastúcim zväčšením slabne. Preto je lepšie na pozorovanie väčších vzoriek materiálov.
2. Fluorescenčný mikroskop s padajúcim lúčom Ide o nový typ fluorescenčného mikroskopu vyvinutý v modernej dobe. Na rozdiel od predchádzajúceho dopadá excitačné svetlo zo šošovky objektívu na povrch preparátu, pričom sa používa rovnaká šošovka objektívu ako osvetľovací kondenzor a šošovka objektívu na zber fluorescencie. K optickej dráhe, ktorá je v uhle 45 stupňov k ľahkému uránu, je potrebné pridať dvojfarebný separátor lúčov. Budiace svetlo sa odráža do šošovky objektívu a sústreďuje sa na vzorku. Fluorescencia generovaná vzorkou, ako aj excitačné svetlo odrazené od povrchu šošovky objektívu a krycieho skla vstupujú súčasne do šošovky objektívu a vracajú sa do separátora dichroického lúča, čím sa oddeľuje excitácia a fluorescencia. Zvyškové budenie je potom absorbované blokovacím filtrom. Ak sa použijú rôzne kombinácie excitačných filtrov/dvojfarebných lúčových separátorov/blokovacích filtrov, môžu spĺňať potreby rôznych produktov fluorescenčnej reakcie. Výhodou tohto fluorescenčného mikroskopu je, že osvetlenie zorného poľa je rovnomerné, zobrazenie je jasné a čím väčšie zväčšenie, tým silnejšia je fluorescencia.
