Princípy konfokálnej mikroskopie
Konfokálny mikroskop je vysoko presný zobrazovací prístroj, ktorý sa objavil a vyvinul v 80. rokoch minulého storočia a je základným vedeckým výskumným nástrojom na štúdium submikrónových štruktúr. S rozvojom počítačov, softvéru na spracovanie obrazu a laserov prešli veľkým vývojom aj konfokálne mikroskopy, ktoré sa v súčasnosti široko používajú v oblasti biológie, mikrosystémov a merania materiálov. Konfokálny mikroskop je nový typ mikroskopu integrujúci konfokálny princíp, technológiu skenovania a technológiu spracovania počítačovej grafiky. Jeho hlavné výhody sú: vysoké bočné rozlíšenie a vysoké axiálne rozlíšenie a efektívne potlačenie rozptýleného svetla s vysokým kontrastom.
Typické nastavenie konfokálneho mikroskopu spočíva v umiestnení dvoch malých otvorov na konjugovanú rovinu ohniskovej roviny meraného objektu, z ktorých jeden je umiestnený pred svetelným zdrojom a druhý je umiestnený pred detektorom, ako je znázornené na obrázku 1. Z obrázku je možné vidieť, že keď je meraná vzorka v kvázi ohniskovej rovine, intenzita svetla zachytená detekčným koncom je najväčšia; keď je meraná vzorka v rozostrenej polohe, svetelný bod na detekčnom konci sa rozptýli a intenzita svetla rýchlo klesá. Preto môže cez výstupnú dierku prechádzať iba svetlo vyžarované bodmi na ohniskovej rovine, zatiaľ čo svetlo vyžarované bodmi mimo ohniskovej roviny je na výstupnej dierkovej rovine rozostrené a väčšina z nich nemôže prechádzať cez stredovú dierku. Preto sa cieľový bod pozorovania na ohniskovej rovine javí ako jasný a nepozorovaný bod sa javí ako čierny ako pozadie, čím sa zvyšuje kontrast a vyjasňuje sa obraz. Počas procesu zobrazovania sú dve dierky konfokálne, konfokálny bod je detegovaný bod a rovina, kde sa nachádza detegovaný bod, je konfokálna rovina.
Veľkosť dierky na detektore v konfokálnej mikroskopii hrá rozhodujúcu úlohu. Priamo ovplyvňuje rozlíšenie a odstup signálu od šumu systému. Ak je dierka príliš veľká, nedosiahne sa efekt konfokálnej detekcie, čo nielen znižuje rozlíšenie systému, ale tiež zavádza viac rozptýleného svetla; ak je dierka príliš malá, zníži to účinnosť detekcie a zníži mikroskopický obraz. jas. Štúdie ukázali, že keď sa priemer dierky rovná priemeru Airyho disku, sú splnené konfokálne požiadavky a účinnosť detekcie sa výrazne nezníži. Pretože priemer dierky je vo všeobecnosti rádovo v mikrónoch, ak dôjde k odchýlke medzi bodom zaostrenia laserového lúča a polohou dierky, dôjde k skresleniu signálu. Preto konfokálne mikroskopy vo všeobecnosti používajú systém automatického zaostrovania, ktorý prakticky predlžuje čas merania.
Keďže laserový konfokálny rastrovací mikroskop je bodové zobrazovanie, na získanie dvojrozmerného obrazu objektu je potrebné použiť dvojrozmerné skenovanie v smere x a y. Rôzne mikroskopy používajú rôzne metódy skenovania:
(1) Skenovanie objektov. To znamená, že samotný objekt sa pohybuje podľa určitého zákona, zatiaľ čo svetelný lúč zostáva nezmenený. Výhody: stabilná optická dráha; Nevýhody: je potrebný veľký skenovací stôl, takže rýchlosť skenovania je značne obmedzená.
(2) Systém skenovania lúčom je vytvorený pomocou reflexného galvanometra. To znamená, že ovládaním skenovacieho galvanometra sa zaostrený svetelný bod pravidelne odráža do určitej vrstvy objektu, aby sa dokončilo dvojrozmerné skenovanie. Jeho výhodou je, že má vysokú presnosť a často sa používa na veľmi presné meranie. Rýchlosť skenovania sa oproti skenovaniu objektov zlepšila, no stále nie je rýchla.
(3) Na skenovanie použite akusticko-optický vychyľovací prvok a skenovanie sa realizuje zmenou výstupnej frekvencie zvukovej vlny a následnou zmenou smeru prenosu svetelnej vlny. Jeho mimoriadnou výhodou je veľmi vysoká rýchlosť skenovania. Skenovací systém vyvinutý Spojenými štátmi využíva akusticko-optický deflektor na generovanie videoobrazov v reálnom čase. Naskenovanie dvojrozmerného obrazu trvá iba 1/30 s a takmer dosiahne výstup v reálnom čase.
(4) Skenovanie disku Nipkow. Proces skenovania je ukončený otáčaním disku Nipkow, pričom ostatné komponenty zostávajú v pokoji. Dá sa nasnímať naraz a rýchlosť je veľmi rýchla. Keďže však zobrazovací lúč je svetlo mimo osi, musí sa korigovať mimoosová aberácia šošovky a miera využitia svetelnej energie je veľmi nízka.
