Princípy fluorescenčnej mikroskopie
Fluorescenčné mikroskopy sa líšia od bežných optických mikroskopov. Namiesto pozorovania vzoriek pri osvetlení bežnými zdrojmi svetla používajú svetlo určitej vlnovej dĺžky (zvyčajne ultrafialové svetlo, modrofialové svetlo) na excitáciu fluorescenčných látok vo vzorkách pod mikroskopom, aby vyžarovali fluorescenciu. Svetelný zdroj fluorescenčného mikroskopu preto nefunguje ako priame osvetlenie, ale ako zdroj energie, ktorý excituje fluorescenčné látky vo vzorke. Dôvodom, prečo môžeme vzorku pozorovať, je osvetlenie svetelného zdroja, ale fenomén fluorescencie prezentovaný po tom, čo fluorescenčná látka vo vzorke absorbuje excitovanú svetelnú energiu.
Je vidieť, že vlastnosťou fluorescenčného mikroskopu je, že jeho svetelný zdroj môže dodať veľké množstvo excitačného svetla v špecifickom rozsahu vlnových dĺžok, takže fluorescenčná látka v testovanej vzorke môže získať excitačné svetlo potrebnej intenzity. Zároveň musí mať fluorescenčný mikroskop zodpovedajúci filtračný systém.
Fluorescenčná mikroskopia je základným nástrojom v imunofluorescenčnej histochémii. Skladá sa z ultravysokonapäťového svetelného zdroja, filtračného systému (vrátane excitačnej a potlačovacej filtračnej dosky), optického systému a fotografického systému a ďalších hlavných komponentov. Využíva svetlo určitej vlnovej dĺžky na vybudenie vzorky, aby vyžarovala fluorescenciu.
Spôsob excitácie fluorescencie: Podľa rozsahu vlnových dĺžok svetla sa dá rozdeliť na dva typy: metóda UV excitácie (pomocou metódy ultrafialového osvetlenia) a metóda BV excitácie (pomocou modrofialového svetla). Metóda UV excitácie využíva na excitáciu blízke ultrafialové svetlo kratšie ako 400 nm. Pri tejto metóde nie je žiadne viditeľné excitačné svetlo, takže pozorovaná fluorescencia predstavuje inherentnú fluorescenciu farbiva a je ľahké rozlíšiť špecifickú fluorescenciu na vzorke od autofluorescencie tkaniva pozadia.
Metóda BV excitácie je založená na 404nm a 434nm pre excitáciu z ultrafialového na modré svetlo. Táto metóda využíva modré svetlo na ožarovanie preparátu, takže hraničný filter fluorescenčného pozorovacieho systému musí používať filter, ktorý dokáže úplne zablokovať modré svetlo a úplne prepustiť požadovanú zelenú a žltú fluorescenciu. Fluorescenčné farbivá pre fluorescenčné testy protilátok. Maximálna absorpčná vlnová dĺžka excitačného svetla je relatívne blízka maximálnej emisnej vlnovej dĺžke fluorescencie, takže filter používaný v BV excitačnej metóde musí používať filter s ostrým medzným rozsahom. Táto metóda môže používať modré svetlo ako excitačné svetlo, takže absorpčná účinnosť fluorescenčného pigmentu je vyššia a možno získať jasnejší obraz. Jeho nevýhodou je, že fluorescenciu pod 500 nm nie je možné vidieť a fluorescencia nad 500 nm spôsobí, že sa celý obraz javí žltý. Pri fluorescenčnej protilátkovej metóde sa špecifickosť fluorochrómu často posudzuje podľa farby jedinečnej pre fluorochróm. Preto pri diskusii o jemnej špecifickosti majú často veľký vplyv vyššie uvedené nedostatky BV excitačnej metódy.
Suma sumárum, osvetlenie fluorescenčného mikroskopu možno uvažovať podľa nasledujúcich troch bodov podľa štruktúry kondenzora a vlnovej dĺžky excitačného svetla.
① Z pohľadu požiadaviek na kontrast fluorescenčného obrazu sa na osvetlenie používa ultrafialový koncentrátor tmavého poľa.
② Vzhľadom na jas obrazu má BV excitačný filter najvyššiu účinnosť pozorovania v tmavom poli.
③Charakteristiky pozorovania tmavého poľa s UV excitačným filtrom a osvetlenia koncentrátora tmavého poľa BV excitácie možno považovať za medzi týmito dvoma spôsobmi osvetlenia, ale prvý z nich má silnejšie vlastnosti tmavého poľa a zobrazuje jasnejšie obrázky. Kontrast je malý; ten si zachováva vlastnosti svetelnej dráhy tmavého poľa, takže zobrazený obraz je tmavší a kontrast sa zlepšuje. Pri skutočnom použití fluorescenčného mikroskopu by sa na pozorovanie mala použiť metóda osvetlenia, ktorá najlepšie vyhovuje požiadavkám vzorky.
Je potrebné zdôrazniť, že aj keď je kondenzor tmavého poľa s najlepším kontrastom osvetlený ultrafialovým svetlom, časť ultrafialového excitačného svetla lomeného alebo rozptýleného vzorkou prenikne do šošovky objektívu. Autofluorescencia môže zhoršiť odozvu obrazu. Preto sa musí pred okulárom použiť filter pohlcujúci UV žiarenie ako oddeľovací filter.
