Posúvanie limitov mikroskopie s vysokým rozlíšením: samonastavovacia mikroskopia
Ultra-presná mikroskopia, ktorá presahuje obmedzenia nositeľa Nobelovej ceny za superrozlíšenie mikroskopu, umožní vedcom priamo merať vzdialenosti medzi jednotlivými molekulami.
Lekárski výskumníci z University of New South Wales dosiahli bezprecedentné rozlíšenie v jednomolekulovej mikroskopii na detekciu interakcií medzi jednotlivými molekulami v intaktných bunkách.
Nobelova cena za chémiu za rok 2014 bola udelená za vývoj technológie fluorescenčnej mikroskopie s vysokým rozlíšením, ktorá poskytla mikroskopom prvý molekulárny pohľad do vnútra bunky, čo je funkcia, ktorá poskytuje nové molekulárne pohľady na zložité biologické systémy a procesy.
Teraz boli detekčné limity jednomolekulovej mikroskopie opäť posunuté a podrobnosti boli zverejnené v najnovšom vydaní Science Advances.
Bolo možné pozorovať a sledovať jednotlivé molekuly pomocou mikroskopov s ultravysokým rozlíšením, ale interakcie medzi týmito molekulami sa vyskytujú v mierke, ktorá je najmenej štyrikrát menšia ako tá, ktorú rozlišujú existujúce mikroskopy s jednou molekulou.
"Dôvod, prečo majú mikroskopy s jednou molekulou zvyčajne presnosť lokalizácie okolo 20 až 30 nanometrov, je zvyčajne ten, že mikroskop sa pri detekcii signálov skutočne pohybuje. To vedie k neistote. Pomocou existujúcich nástrojov s vysokým rozlíšením sa nám nepodarí určiť, či je jeden proteín naviazaný na inú preto, že vzdialenosť medzi nimi je kratšia ako neistota v ich pozíciách.“
Na vyriešenie tohto problému tím vytvoril automatizovanú spätnú väzbu vo vnútri jednomolekulového mikroskopu, ktorá detekuje a prestavuje optickú dráhu a zrkadlový stupeň.
"Nezáleží na tom, čo s týmto mikroskopom robíte, v podstate nájde spätnú cestu s nanometrovou presnosťou. Je to inteligentný mikroskop. Dokáže všetko, čo operátor alebo servisný technik potrebuje, a to 12-krát za sekundu." " Povedal prof. Goss.
Meranie vzdialenosti medzi proteínmi
S dizajnom a metodológiou načrtnutou v tomto dokumente tím UNSW navrhol systém spätnej väzby, ktorý je kompatibilný s existujúcimi mikroskopmi a poskytuje maximálnu flexibilitu pri príprave vzoriek.
"Toto je veľmi jednoduché a elegantné riešenie veľkého problému so zobrazovaním. Práve sme postavili mikroskop vo vnútri mikroskopu a všetko, čo sme urobili, bolo zarovnanie hlavného mikroskopu. Jednoduchosť a praktickosť riešenia, ktoré sme našli, je jeho skutočná sila. Je ľahké ho klonujte systém a rýchlo prijímajte nové technológie." Povedal prof. Goss.
Na demonštráciu užitočnosti svojho ultra presného spätnoväzbového mikroskopu s jednou molekulou ho výskumníci použili na priame merania vzdialenosti medzi signálnymi proteínmi v T bunkách. Spoločným predpokladom v bunkovej imunológii je, že tieto imunitné bunky zostávajú v pokoji, keď je receptor T-buniek blízko inej molekuly, ktorá pôsobí ako brzda.
Ich vysoko presná mikroskopia dokázala ukázať, že dve signalizačné molekuly boli v skutočnosti v aktivovaných T bunkách od seba ďalej oddelené, čím uvoľnili brzdu a zapli signalizáciu T bunkových receptorov.
Prof. Goss povedal: "Konvenčné mikroskopické techniky by nedokázali presne zmerať takú malú zmenu, pretože vzdialenosť medzi týmito signálnymi molekulami v pokojových a aktivovaných T bunkách sa líši len o 4-7 nanometrov."
"To tiež ukazuje, aké citlivé sú tieto signalizačné mechanizmy na priestorovú izoláciu. Na identifikáciu takýchto regulačných procesov musíme vykonať presné merania vzdialenosti, čo tento mikroskop umožňuje. Tieto výsledky ilustrujú, že technológia je v štádiu objavovania a nemožno ju vyrobiť v žiadnom iná cesta."
