Farbiace techniky a mikroskopické pozorovanie mikroorganizmov
Jednoduché farbenie baktérií
1 Ciele
1.1 Naučiť sa základné techniky mikrobiálneho náteru a farbenia.
1.2 Zvládnuť jednoduchú metódu farbenia baktérií.
1.3 Zoznámiť sa s morfologickými charakteristikami baktérií a upevniť si učenie sa používania olejových zrkadiel a techník aseptických operácií.
2 Princíp Rozmazanie a farbenie baktérií je základnou technikou v mikrobiologických experimentoch. Bunky baktérií sú malé a priehľadné, nie sú ľahko rozpoznateľné pod bežným svetelným mikroskopom a musia byť zafarbené. Použitie jedného farbiva na zafarbenie baktérií, aby zafarbený organizmus a pozadie vytvorili jasný farebný rozdiel, aby bolo možné jasnejšie pozorovať ich morfológiu a štruktúru. Táto metóda sa ľahko vykonáva a je vhodná na pozorovanie celkového tvaru organizmu a usporiadania baktérií. Alkalické farbivá sa bežne používajú na jednoduché farbenie, pretože v neutrálnych, alkalických alebo slabo kyslých roztokoch sú bakteriálne bunky zvyčajne negatívne nabité a keď sú alkalické farbivá ionizované, farbiaca časť ich molekúl je nabitá kladne, takže farbiaca časť alkalických farbív sa môžu ľahko naviazať na baktérie, aby sa baktérie zafarbili. Zafarbené bakteriálne bunky ostro kontrastujú s pozadím a sú ľahšie rozpoznateľné pod mikroskopom. Bežne používané farbivá na jednoduché farbenie zahŕňajú merocyanínovú modrú, kryštálovú violeť a zásaditú červeň. Pri bakteriálnom rozklade cukru vzniká kyselina tak, že pH média klesá, kladný náboj baktérií sa zvyšuje a potom sa môžu použiť na farbenie červenou, kyslou červenou alebo konžskou červeňou a inými kyslými farbivami. Baktérie musia byť pred farbením fixované. Jeho účel je dvojaký: jedným je zabiť baktérie a prinútiť baktérie priľnúť na sklíčko; druhým je zvýšenie jeho afinity k farbivu. Bežne sa používajú dve metódy: zahrievanie a chemická fixácia. Pri fixácii sa snažte zachovať pôvodnú morfológiu buniek.
3 Materiály
3.1 Kmeň Bacillus subtilis 12-18h kultiváciu na živnom agare, Staphylococcus aureus asi 24-hodinovú kultúru na živnom agare, Escherichia coli 24-hodinovú kultúru na živnom agare, šikmú kultúru na agare z pekárskych kvasníc.
3.2 Farbenie Lueovo alkalické farbenie metylénovou modrou (alebo farbenie kryštálovou violeťou šťavelanu amónneho), červené farbenie zlúčeniny kyseliny karbolovej.
3.3 Nástroje alebo iné príslušenstvo Mikroskop, alkoholová lampa, podložné sklíčko, očkovací krúžok, držiak podložného sklíčka, dvojvrstvová fľaša (naplnená cédrovým olejom a xylénom), mikroskopický papier, fyziologický roztok alebo destilovaná voda atď.
4 Postup Smear → sušenie → fixácia → farbenie → umývanie → sušenie → mikroskopické vyšetrenie.
5 krokov
5.1 náter Vezmite dve čisté a bezolejové podložné sklíčka, každé s malou kvapkou fyziologického roztoku (alebo destilovanej vody) v strede podložného sklíčka za aseptických podmienok, s očkovacím krúžkom na aseptickú manipuláciu z Bacillus subtilis, Garcinia micrococcus a Escherichia coli šikmo vybrať trochu machu v kvapke vody, premiešať a potiahnuť filmom. Ak je bakteriálna suspenzia (alebo tekutá kultúra) rozmazaná, možno použiť na naočkovanie krúžku, vyberte 2 až 3 krúžky priamo na sklíčko. Všimnite si, že fyziologický roztok (destilovaná voda) a baktérie by nemali byť príliš veľa a rovnomerne rozložené, nie príliš husté.
5.2 Sušenie Sušte prirodzene pri izbovej teplote. Môže sa tiež sušiť mierne zahrievaním nad alkoholovou lampou potiahnutou stranou nahor. Nepribližujte sa však príliš blízko k plameňu, pretože príliš vysoká teplota zničí morfológiu baktérií.
5.3 Fixácia Ak sa používa sušenie teplom, fixácia a sušenie sú spojené do jedného kroku rovnakým spôsobom ako sušenie. Namažte, vysušte a zafixujte teplom.
5.4 Farbenie Položte podložné sklíčko naplocho na policu podložných sklíčok, pridajte 1 až 2 kvapky farbiaceho roztoku na náter (vhodné je, že farbiaci roztok len prekryje náterový film). Zafarbite náter Lü's Basic Mellanox Blue na 1~2 minúty a Carbonate Red (alebo amónium-oxalát Crystal Violet) asi 1min.
5.5 Oplachovanie Zlejte farbiaci roztok a jemne opláchnite vodou z vodovodu z jedného konca podložného sklíčka, kým voda stekajúca z náteru nebude bezfarebná. Pri oplachovaní nenechajte vodu priamo tiecť na umytie natretého povrchu. Prúd vody by nemal byť príliš rýchly alebo príliš veľký, aby nedošlo k uvoľneniu náterového filmu.
5.6 Sušenie Kvapky vody na podložnom sklíčku potraste, aby prirodzene vyschli, vysušte ich vyfúkaním alebo použite savý papier na absorbovanie (pozor, aby ste nezotreli telo baktérie). 5.7 Mikroskopické vyšetrenie Náter sa vysuší a skúma mikroskopicky. Pred pozorovaním olejovým mikroskopom musí byť náter úplne suchý.
6 Výsledky Nakreslite morfológiu E. coli a Micrococcus garciniae po jedinom zafarbení.
Gram Stain
1 Účel
1.1 Pochopiť princíp Gramovho farbenia a jeho význam pri klasifikácii a identifikácii baktérií.
1.2 Naučiť sa a osvojiť si techniku farbenia podľa Grama a upevniť si učenie sa používania olejových šošoviek svetelného mikroskopu.
