Technické vlastnosti a zručnosti použitia dvojfotónového fluorescenčného mikroskopu
Dvojfotónová fluorescenčná mikroskopia je nová technológia, ktorá kombinuje laserovú skenovaciu konfokálnu mikroskopiu a technológiu dvojfotónovej excitácie.
Základný princíp dvojfotónovej excitácie je: v prípade vysokej hustoty fotónov môžu fluorescenčné molekuly absorbovať dva fotóny s dlhou vlnovou dĺžkou súčasne a po krátkej dobe života v takzvanom excitovanom stave emitovať fotón s kratšou vlnovou dĺžkou. . ; Účinok je rovnaký ako pri použití fotónu s polovičnou vlnovou dĺžkou ako je dlhá vlnová dĺžka na excitáciu fluorescenčnej molekuly. Dvojfotónová excitácia vyžaduje vysokú hustotu fotónov. Aby nedošlo k poškodeniu buniek, dvojfotónová mikroskopia využíva vysokoenergetické pulzné lasery s uzamknutým režimom. Laser vyžarovaný týmto laserom má vysokú špičkovú energiu a nízku priemernú energiu, jeho šírka pulzu je iba 100 femtosekúnd a jeho perióda môže dosiahnuť 80 až 100 megahertzov. Pri použití šošovky objektívu s vysokou numerickou apertúrou na zaostrenie fotónov pulzného lasera je hustota fotónov v ohnisku šošovky objektívu najvyššia a k dvojfotónovej excitácii dochádza iba v ohnisku šošovky objektívu, takže dvojfotónový mikroskop nepotrebuje konfokálnu dierku, čo zlepšuje účinnosť detekcie fluorescencie. Je to dôležitá výskumná metóda v oblasti morfológie, molekulárnej bunkovej biológie, neurovedy a farmakológie.
1. Pozadie vzniku dvojfotónovej mikroskopie - dve obmedzenia tradičnej laserovej konfokálnej mikroskopie:
1) Jedným z nich je fenomén fototoxicity: pretože konfokálna dierka musí byť dostatočne malá na získanie obrazu s vysokým rozlíšením a malý otvor bude blokovať veľkú časť fluorescencie vyžarovanej zo vzorky, vrátane fluorescencie vyžarovanej z ohniskovej roviny, zodpovedajúce Áno, budiace svetlo musí byť dostatočne silné na získanie dostatočného odstupu signálu od šumu; a laser s vysokou intenzitou spôsobí, že fluorescenčné farbivo počas nepretržitého skenovania rýchlo vybledne a fluorescenčný signál bude v priebehu skenovania stále slabší.
2) Ďalším problémom je fototoxicita. Pri laserovom ožiarení bude veľa molekúl fluorescenčného farbiva produkovať cytotoxíny, ako je singletový kyslík alebo voľné radikály, takže čas skenovania a hustota optickej sily excitačného svetla by mali byť v experimente obmedzené, aby sa zachovala hustota vzorky. aktívny. Pri výskume aktívnych vzoriek, najmä rôznych štádií rastu a vývoja aktívnych vzoriek, fotobielenie a fototoxicita tieto štúdie veľmi obmedzujú.
2. Prečo hovoríte, že dvojfotónové mikroskopy vo všeobecnosti nemusia byť vybavené ultrafialovými excitačnými lasermi?
Dvojfotónová mikroskopia je technológia fluorescenčnej excitácie založená na efekte dvojfotónovej excitácie: molekuly fluorescenčného farbiva môžu byť excitované absorpciou dvoch fotónov s nízkou energiou súčasne (časový interval medzi dvoma fotónmi, ktoré dosiahnu fluorescenčné molekuly, je menší ako 1 femtosekunda ), jeho excitačný účinok môže byť ekvivalentný absorpcii vysokoenergetického fotónu s 1/2 vlnovou dĺžkou. Napríklad absorpcia dvoch fotónov pri červených vlnových dĺžkach je ekvivalentná molekule absorbujúcej ultrafialové žiarenie. Fotóny s dlhou vlnovou dĺžkou nie sú bunkami ľahko absorbované, takže fototoxicita pre živé bunky je znížená a tiež je znížené fotobielenie. Týmto spôsobom plní nielen funkciu ultrafialovej excitácie, ale tiež zabraňuje poškodeniu vzorky ultrafialovým svetlom.
3. Čo je zvláštne na laseri dvojfotónového mikroskopu?
Pravdepodobnosť dvojfotónovej absorpcie závisí od toho, ako blízko sa dva dopadajúce fotóny zhodujú v priestore a čase (dva fotóny musia doraziť do 10-18 sekúnd). Dvojfotónový absorpčný prierez je malý a excitované sú iba fluorofóry v oblastiach s veľkým tokom fotónov. Preto väčšina používaných laserov sú titánové zafírové lasery, ktoré môžu dosiahnuť pikosekundové alebo femtosekundové rýchlosti skenovania a majú veľmi vysoký špičkový výkon a nízky priemerný výkon, takže je možné znížiť alebo eliminovať fotobielenie a fototoxicitu. Najdôležitejšie je poskytnúť veľmi vysokú hustotu fotónov v malom rozsahu, čo dokáže zabezpečiť súčasné vybudenie dvoch fotónov.
4. Aké sú výhody dvojfotónovej excitácie?
1) Zvýšte selektivitu farbiva: rozsah excitačného svetla lasera konfokálneho systému (Ar, Ar/Kr, HeNe) je 488nm - 647nm. To znamená experimentovať s UV-excitovanými fluorescenčnými farbivami, napr. s DAPI, Hoescht. Excitačná vlnová dĺžka dvojfotónu je dvojnásobná ako jednofotónová, takže farbivá excitované ultrafialovým svetlom môžu byť excitované blízkym infračerveným svetlom.
2) Zníženie odfarbovania svetlom: Z dôvodu zníženia odfarbovania svetlom sa zvyšuje úspešnosť experimentov s použitím CFP/YFP na prenos fluorescenčnej rezonančnej energie (FRET).
3) Nevyžaduje sa žiadna špeciálna šošovka objektívu: Z hardvérového hľadiska si excitácia UV-excitovaných farbív s vlnovou dĺžkou blízkeho infračerveného svetla nevyžaduje špeciálne UV optické komponenty.
4) Zlepšite pomer signálu k šumu: vlnová dĺžka excitačného svetla a vlnová dĺžka emitovaného svetla majú veľký rozdiel, čo zlepšuje pomer signálu k šumu.
5) Bielenie lokalizované v ohnisku: Pretože excitácia fluorescencie nastáva iba v ohnisku objektívu, nie je potrebná konfokálna dierka. To zlepšuje detekciu svetla a fotobielenie sa vyskytuje iba v ohnisku.
6) Ľahšie preniknutie do vzoriek: Infračervené svetlo s vlnovou dĺžkou nie je ľahko rozptýlené bunkami a môže preniknúť hlbšie do vzoriek.
5. Aké je najväčšie zlepšenie dvojfotónovej mikroskopie v porovnaní s laserovou skenovacou konfokálnou mikroskopiou?
1) Znížené fotobielenie.
2) Znížená fototoxicita.
3) Nie je ľahké ho rozptýliť a je ľahšie preniknúť do hrubých vzoriek, ako sú mozgové rezy.
