Rozdiel medzi pozitívnym a negatívnym fázovým kontrastom v mikroskope
V závislosti od konfigurácie a povahy fázového prstenca umiestneného v zadnej ohniskovej rovine objektívu možno vzorky pozorovať v pozitívnom alebo negatívnom fázovom kontraste. Tento interaktívny návod študuje vzťah medzi priestorom (S), difrakciou (D) a výslednými jasnými časticami (P vlny), ako aj mikroskopiou s pozitívnym a negatívnym fázovým kontrastom. Okrem toho je prezentovaná aj geometria fázovej dosky a reprezentatívne ukážkové obrázky.
Keď to teraz ľudia používajú vo svojej práci, väčšina výskumníkov je v negatívnom rozdiele a teraz pozitívny rozdiel nehrá veľkú rolu v súčasnej vedeckovýskumnej práci.
Návod inicializuje fázový obraz s náhodne vybranou vzorkou, ktorá sa zobrazí v okne Fázový kontrastný obraz, a zodpovedajúci vlnový vzťah sa zobrazí v ľavom susedstve okna s obrazom. Ak chcete použiť návod, použite kurzor myši na pohyb medzi kladným a záporným fázovým kontrastom alebo posúvačom režimu fázového kontrastu jasného osvetlenia. Keď sa posúvač posunie, obrázky, ktoré sa objavia v okne obrázka s fázovým kontrastom, zmenia vzhľad preparátu v aktuálnom režime zobrazenia nastavenom posúvačom. Pod grafom priebehu je tiež fázová doska, ktorá mení tvar tak, aby zodpovedal zobrazovaciemu režimu zvolenému posuvníkom. Ak chcete zobraziť novú vzorku, použite rozbaľovaciu ponuku Vybraná vzorka na výber inej vzorky.
Graf konfigurácie fázovej platne, vlnových vzťahov a vektorov spojených s generovaním pozitívnych a negatívnych obrazov fázového kontrastu je uvedený na obrázku 1. Sú zobrazené aj príklady vzoriek zobrazených týmito technikami. V optickej konfigurácii s pozitívnym fázovým kontrastom (horný riadok obrázka na obrázku 1) prechádza priestorová (S) vlna cez fázovú platňu, čo vedie k čistému fázovému posunu o 180 stupňov fázového posunu o 1/4 vlnovej dĺžky ( 1 polovičná vlnová dĺžka). Pokročilé priestorové vlnoplochy sú teraz schopné podieľať sa na deštruktívnej interferencii s difraktovanými (D) vlnami v strednej rovine obrazu. Vo väčšine prípadov samotné posunutie relatívnej fázy okolitého čela vlny nestačí na vytvorenie vysoko kontrastných obrázkov v mikroskopoch Nikon. Je to preto, že amplitúda priestorových vĺn je výrazne väčšia ako amplitúda difraktovaných vĺn a potláča výsledný obraz vytvorený interferenciou zlomku celkového počtu vĺn. Aby sa zmenšila okolitá vlnoplocha na hodnotu bližšiu amplitúde difraktovaných vĺn (a došlo k interferencii v rovine obrazu), opacita vo fázovom prstenci objektívu sa získa aplikáciou polopriehľadného kovu (neutrálna zvyšujúca sa hustota ) náter Podlaha. Okolité svetelné vlny, ktoré podľa návrhu takmer úplne prechádzajú fázovým prstencom pod mikroskopom s fázovým kontrastom, sú výrazne znížené v amplitúde opacitou fázovej platne na hodnotu v rozsahu 10 až 30 percent pôvodnej intenzity.
Pretože výsledná časticová vlna je produkovaná interferenciou* okolitých a difraktovaných vlnoploch, amplitúda vlny častíc (P) produkovanej interferenciou medzi vlnoplochami prichádzajúcimi do roviny obrazu je teraz oveľa menšia ako okolitá vlna v sexuálnom režime. nanesený hustotný náter. Čistým efektom je premena relatívneho fázového rozdielu zavedeného prechodom svetla vychádzajúceho z roviny obrazu cez preparát na rozdiel v amplitúde (intenzite). Pretože ľudské oko interpretuje rozdiel v intenzite ako kontrast, preparát je teraz viditeľný v okulári mikroskopu a môže byť tiež zachytený na membráne konvenčnými kamerovými systémami alebo digitálne pomocou CCD alebo CMOS zariadení. Všetky systémy s pozitívnym fázovým kontrastom selektívne posúvajú fázu lineárnej priestorovej (S)-vlny vzhľadom na sférickú difraktovanú (D) vlnovú plochu. Vzorky s vyšším indexom lomu ako okolité médium sa javia tmavšie na neutrálnom sivom pozadí, zatiaľ čo vzorky s nižším indexom lomu ako plavecké médium sa javia svetlejšie ako sivé pozadie.
Aby sa upravilo priestorové oddelenie difraktovaných čela vĺn obklopujúcich fázu a amplitúdu v optickom systéme s fázovým kontrastom, bolo zavedené množstvo konfigurácií fázových platní. Pretože fázová doska je umiestnená v zadnej ohniskovej rovine objektívu (difrakčná rovina) alebo veľmi blízko k nej, všetko svetlo, ktoré prechádza mikroskopom, musí prechádzať cez tento komponent. Časť fázovej platne v jej prstencovom ohnisku kondenzátora sa nazýva konjugovaná oblasť, zatiaľ čo zostávajúca oblasť sa nazýva komplementárna oblasť. Konjugovaná oblasť obsahuje materiál zodpovedný za zmenu fázy okolitého (nefraktovaného) svetla buď o plus alebo mínus 90 stupňov vzhľadom na difraktované čelo vlny. Vo všeobecnosti je oblasť fázovo konjugovaného kruhu širšia (asi o 25 percent) ako oblasť definovaná obrazom kondenzačného kruhu, aby sa znížilo množstvo okolitého svetla, ktoré sa šíri do komplementárnej oblasti.
Väčšina fázových platní dostupných od moderných výrobcov mikroskopov je jedným z tých, ktoré sú pripravené vákuovým nanášaním tenkých dielektrických a kovových filmov na sklenenú platňu alebo pripevnené priamo na povrch šošovky objektívu mikroskopu. Úlohou dielektrického filmu je fázovať svetlo, zatiaľ čo kovový film tlmí intenzitu nelomeného svetla. Niektorí výrobcovia používajú viacero antireflexných vrstiev kombinovaných s fóliou, aby sa znížilo množstvo odleskov a odrazu rozptýleného svetla späť do optického systému. Ak fázová doštička nie je vytvorená na povrchu šošovky, je zvyčajne pripevnená medzi po sebe idúce šošovky, ktoré sa nachádzajú v ohniskovej rovine v blízkosti zadnej časti objektívu. Hrúbka a index lomu dielektrických, kovových a antireflexných povlakov, ako aj optického cementu, sa starostlivo vyberajú tak, aby sa dosiahol požadovaný fázový posun medzi komplementárnymi a konjugovanými oblasťami fázovej platne. Z optického hľadiska sa fázová doska, ktorá mení fázu vzhľadom na okolité svetlo, aby ohýbala svetlo o 90 stupňov (buď pozitívna alebo negatívna), sa nazýva štvrťvlnová doska, pretože na ňu má vplyv rozdiel v optickej dráhe.
Prehľad inverznej kladnej fázy je znázornený na obrázku 1. Kontrastná doska s kladnou fázou (ľavá strana obrázku 1) poháňa obklopujúcu vlnu o 1/4 vlnovej dĺžky v dôsledku erózneho prstenca v sklenenej doske, ktorý môže byť znížená o horný priechod v doske s vysokým indexom Fyzická dráha vlny. V dôsledku interakcie so vzorkou, keď sú difraktované lúče vzorky (D) oneskorené, rozdiel optickej dráhy medzi obklopujúcimi a difraktovanými vlnami, ktoré vychádzajú z fázovej platne, je polovičná vlnová dĺžka krát 1/4 vlnovej dĺžky. Čistým výsledkom je 180-stupňový rozdiel optickej dráhy medzi okolitými a difraktovanými vlnami, čo vedie k deštruktívnej interferencii pre vzorky s vysokým indexom lomu medzi rovinami obrazu. Krivka amplitúdy pre kladnú fázu opačnej deštruktívnej interferenčnej vlny je znázornená v hornom grafe na obrázku 1. Výsledná časticová vlna (P) má nižšiu amplitúdu ako okolitá (S) vlna, takže objekt vyzerá v porovnaní s relatívne tmavšie pozadie. Dole, obrázok zelených rias Zygnema zobrazený vpravo (označený DL). Vektor reprezentovaný priebehom 1/4 vlnovej dĺžky, ktorý je znázornený ako 90-stupeň proti smeru hodinových ručičiek rotujúca priestorová vlna v pozitívnom fázovom kontraste, sa objavuje medzi obrázkom a obrázkom na obrázku 1.
Alternatívne môže byť optika mikroskopu tiež vyrobená tak, aby produkovala opačnú zápornú fázu, ako je znázornené v spodnej časti obrázku 1, pričom v tomto prípade sú priestorové (S) vlny oneskorené (skôr ako pokročilé) o štvrtinu vlnovej dĺžky vzhľadom na jedna difraktovaná (D) vlna. Výsledkom je, že vzorky s vysokými indexmi lomu vyzerajú jasnejšie na tmavšom sivom pozadí (pozri spodný obrázok označený BM na obrázku 1). V protiľahlej negatívnej fáze obsahuje objektívová fázová doska vyvýšený prstenec, ktorý spomaľuje fázu (skôr než posúva fázu ako opačnú kladnú fázu), pričom prechádza štvrtinou vlnovej dĺžky vzhľadom na fázu difraktovanej vlny ako priestorová vlna nultého rádu. Pretože difraktované vlny boli pri prechode vzorkou oneskorené o štvrtinu vlnovej dĺžky, rozdiel v optickej dráhe medzi okolitými a difraktovanými vlnami je eliminovaný a vzorka s vysokým indexom lomu konštruktívne interferuje v rovine obrazu. Všimnite si, že výsledná časticová vlna (P) má vyššiu amplitúdu ako priestorová (S) vlna v negatívnom fázovom kontraste. Zobrazený je aj záporný fázový reverz, kde vektor vlny obehu prechádza otočením vektorového diagramu o 90 stupňov v smere hodinových ručičiek.
