Rozdiel medzi (dvojfotónovým, konfokálnym) fluorescenčným mikroskopom a bežným mikroskopom
Základným princípom dvojfotónovej excitácie je to, že pri vysokej hustote fotónov môžu fluorescenčné molekuly súčasne absorbovať dva fotóny s dlhými vlnovými dĺžkami a emitovať kratšiu fotón vlnovej dĺžky po krátkej dobe takzvanej životnosti excitovaného stavu; Účinok je rovnaký ako použitie fotónu s polovicou vlnovej dĺžky dlhej vlnovej dĺžky na excitáciu fluorescenčných molekúl. Dve excitácie fotónov vyžadujú vysokú hustotu fotónov a aby sa zabránilo poškodeniu buniek, dvojfotónová mikroskopia využíva vysoko energetické pulzné lasery s vysokým energetickým režimom. Laser emitovaný týmto laserom má vysokú špičkovú energiu a nízku priemernú energiu, so šírkou pulzov iba 100 femtosekundov a frekvenciou až 80 až 100 megahertz. Pri použití objektívu s vysokou numerickou apertúrou na zaostrenie fotónov pulzného lasera je hustota fotónu v ohnisku objektívnej šošovky najvyššia a excitácia s dvoma fotónmi sa vyskytuje iba v ohniskovom bode objektívnej šošovky. Preto dvojfotónový mikroskop nevyžaduje konfokálnu dierku, ktorá zlepšuje účinnosť detekcie fluorescencie.
Všeobecne fluorescenčné javy, v dôsledku nízkej hustoty fotónu excitačného svetla, môže fluorescenčná molekula absorbovať iba jeden fotón naraz a potom emitovať ďalší fluorescenčný fotón cez radiálny prechod, ktorý je známy ako jednorazová fluorescencia. Pre procesy excitácie fluorescencie využívajúce lasery ako svetelné zdroje môžu dôjsť k fenoménu dvojfotónového alebo dokonca viacstotonového fluorescenčného fenoménu. V tomto prípade má použitý zdroj excitačného svetla vysokú intenzitu a hustotu fotónu, ktorá spĺňa požiadavku, aby fluorescenčné molekuly absorbovali dva fotóny súčasne. V procese použitia všeobecného lasera ako zdroja excitačného svetla je hustota fotónu stále nedostatočná na vytvorenie javu absorpcie s dvoma fotónmi. Typicky sa používajú femtosekundové pulzné lasery, pričom okamžitý výkon dosiahne úroveň Megawatt. Preto je vlnová dĺžka dvojfotónovej fluorescencie kratšia ako pri excitačnom svetle, čo zodpovedá účinku vyvolanému excitácii polovičnej excitačnej vlnovej dĺžky.
Vedomosti týkajúce sa konfokálnej fluorescenčnej mikroskopie
Základným princípom konfokálnej fluorescenčnej mikroskopie je použitie zdroja bodového svetla na ožarovanie vzorky, čím sa na ohniskovej rovine vytvorí dobre definovaná malá svetlá škvrna. Fluorescencia emitovaná z tohto miesta po ožiarení sa zhromažďuje objektívnou šošovkou a odoslaná späť pozdĺž pôvodnej dráhy ožarovania k štiepaniu lúča zloženého z dichroického zrkadla. Spektrometer vysiela fluorescenciu priamo do detektora. Pred zdrojom svetla a detektorom je dierka, ktorá sa nazýva osvetľovacia dierka a detekčná dierka. Geometrické rozmery týchto dvoch sú konzistentné, približne 100-200 nm; V porovnaní so svetelnou škvrnou v ohniskovej rovine sú tieto dve konjugované, čo znamená, že svetelná škvrna prechádza sériou šošoviek a nakoniec sa môže sústrediť na osvetľovaciu dierku a detekčnú dierku súčasne. Týmto spôsobom sa svetlo z ohniskovej roviny môže konvergovať v rozsahu detekčného otvoru, zatiaľ čo rozptýlené svetlo zhora alebo pod ohniskovou rovinou je blokované mimo detekčného otvoru a nedá sa zobrazovať. Skenovanie bodu vzorky po bode laserom, fotomultipličná trubica po detekcii dierky tiež získa zodpovedajúci konfokálny obraz bodového bodu svetelného bodu podľa bodu, prevedie ju na digitálny signál a prenáša ju do počítača a nakoniec ho agreguje do čistého konfokálneho obrazu celého ohniskového roviny na obrazovke.
