Hlavnou pozorovacou metódou optického mikroskopu je fluorescenčné pozorovanie
Fenomén fluorescencie
Fluorescencia sa týka procesu, pri ktorom fluorescenčná látka takmer súčasne vyžaruje svetlo s dlhšou vlnovou dĺžkou, keď je ožiarená svetlom špecifickej vlnovej dĺžky (obrázok 1). Keď svetlo špecifickej vlnovej dĺžky (excitačná vlnová dĺžka) dopadá na molekulu (ako je molekula vo fluorofóre), fotónová energia je absorbovaná elektrónmi molekuly. Potom elektróny prechádzajú zo základného stavu (S0) do vyššej energetickej hladiny, do excitovaného stavu (S1'). Tento proces sa nazýva excitácia①. Elektrón zostane v excitovanom stave 10-9–10-8 sekúnd, počas ktorých elektrón stratí určitú energiu ②. V procese opustenia excitovaného stavu (S1) a návratu do základného stavu ③ sa zvyšná energia absorbovaná počas procesu budenia uvoľní.
Doba zotrvania fluorescenčnej molekuly v excitovanom stave je životnosť fluorescencie, všeobecne v nanosekundách, čo je inherentná charakteristika samotnej fluorescenčnej molekuly. Technológia zobrazovania pomocou fluorescenčnej životnosti sa nazýva Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM), ktorá dokáže okrem zobrazovania intenzity fluorescencie vykonávať aj hlbšie funkčné a presnejšie merania na získanie molekulárnej konformácie, medzimolekulových interakcií a molekulárnych mikroprostredí. informácie, ktoré je ťažké získať konvenčným optickým zobrazovaním.
Ďalšou dôležitou vlastnosťou fluorescencie je Stokesov posun, rozdiel vo vlnovej dĺžke medzi excitačnými a emisnými vrcholmi (obrázok 2). Vlnová dĺžka emisného svetla je zvyčajne dlhšia ako vlnová dĺžka excitačného svetla. Je to preto, že po excitácii fluorescenčnej látky a pred uvoľnením fotónu stratia elektróny časť energie relaxačným procesom. Fluorescenčné látky s väčšími Stokesovými posunmi sa dajú ľahšie pozorovať pod fluorescenčným mikroskopom.
Fluorescenčné mikroskopy a fluorescenčné filtračné bloky
Fluorescenčná mikroskopia je optický mikroskop, ktorý využíva fluorescenčné vlastnosti na pozorovanie a zobrazovanie a je široko používaný v bunkovej biológii, neurobiológii, botanike, mikrobiológii, patológii, genetike a iných oblastiach. Fluorescenčné zobrazovanie má výhody vysokej citlivosti a vysokej špecifickosti a je veľmi vhodné na pozorovanie distribúcie špecifických proteínov, organel atď. v tkanivách a bunkách, štúdium spoločnej lokalizácie a interakcie a sledovanie dynamiky života. procesy, ako sú zmeny koncentrácie iónov.
Väčšina molekúl v bunkách nefluoreskuje a aby ich bolo možné vidieť, musia byť fluorescenčne označené. Existuje mnoho metód fluorescenčného značenia, ktoré možno priamo značiť (napríklad pomocou DAPI na značenie DNA), alebo imunofarbenia pomocou vlastností protilátok viažucich antigén, alebo možno cieľový proteín značiť fluorescenčnými proteínmi (ako je GFP, zelená fluorescenčný proteín) alebo reverzibilná väzba. syntetické farbivá (napríklad Fura-2) atď.
V súčasnosti sa fluorescenčný mikroskop stal štandardným zobrazovacím vybavením rôznych laboratórií a zobrazovacích platforiem a je dobrým pomocníkom pre naše každodenné experimenty. Fluorescenčné mikroskopy sa delia hlavne do troch kategórií: vzpriamené fluorescenčné mikroskopy (vhodné na rezy), inverzné fluorescenčné mikroskopy (vhodné pre živé bunky, berúc do úvahy rezy), fluorescenčné stereoskopické mikroskopy (vhodné pre väčšie vzorky, ako sú rastliny, zebričky (dospelé/ embryo), medaka, orgány myší/potkanov atď.).
Blok fluorescenčného filtra je základnou súčasťou fluorescenčného zobrazovania v mikroskopoch. Pozostáva z budiaceho filtra, emisného filtra a dichroického rozdeľovača lúčov. Je inštalovaný vo filtrovom kolese, ako napríklad Leica DMi8 vybavený 6-polohovým filtrovým kolesom (obrázok 3). ). Rôzne mikroskopy majú rôzne polohy koliesok a niektoré mikroskopy používajú filtračné sklíčka.
Blok filtra hrá dôležitú úlohu pri fluorescenčnom zobrazovaní: excitačný filter vyberá excitačné svetlo na excitáciu vzorky a blokuje iné vlnové dĺžky svetla; svetlo prechádzajúce cez excitačný filter prechádza cez dichroický rozdeľovač lúčov (jeho úlohou je odrážať excitačné svetlo a prenášať fluorescenciu), po odraze je zaostrené šošovkou objektívu, ožiarené na vzorku a príslušná fluorescencia je excitovaná na vyžarovať svetlo. Vyžarované svetlo je zhromažďované šošovkou objektívu, prechádza cez dichroický rozdeľovač lúčov a dosahuje emisný filter. Ako je znázornené na obrázku 4: excitačná vlnová dĺžka je 450-490nm, dichroický rozdeľovač lúčov odráža svetlo kratšie ako 510 nm, prenáša svetlo dlhšie ako 510 nm a rozsah príjmu emisného svetla je 520-560 nm.
Fluorescenčné filtre bežne používané vo fluorescenčných mikroskopoch možno rozdeliť do dvoch typov: dlhý priechod (krátke LP) a pásmový priepust (krátke BP). Pásmová priepust je zvyčajne určená centrálnou vlnovou dĺžkou a šírkou intervalu, napríklad 480/40, čo znamená, že môže prejsť svetlo od 460-500nm. Dlhopriepustné filtre, ako napríklad 515 LP, prepúšťajú svetlo s vlnovými dĺžkami dlhšími ako 515 nm (obrázok 5).
Fluorescenčné látky majú svoju charakteristickú excitačnú (absorpčnú) krivku a emisnú krivku, excitačný vrchol je ideálna excitačná vlnová dĺžka (vysoká excitačná účinnosť, ktorá môže znížiť excitačnú svetelnú energiu, chrániť bunky a farbivá) a emisná krivka je emisná fluorescenčná vlnová dĺžka rozsah. Preto v experimente zvolíme vlnovú dĺžku čo najbližšie k excitačnému vrcholu pre excitáciu a rozsah príjmu musí zahŕňať emisný vrchol. Napríklad excitačný vrchol Alexa Fluor 488 je 500 nm a excitačný filter 480/40 môže byť zvolený vo fluorescenčnom mikroskope.
Podrobnosti o filtračných kockách si môžete pozrieť v zobrazovacom softvéri mikroskopu. Pochopenie farbív a nájdenie filtra, ktorý najlepšie zodpovedá vašej vzorke, je rozhodujúce pre fluorescenčné zobrazovanie. Spektrálne informácie fluorescenčných farbív a fluorescenčných proteínov sú všeobecne uvedené v pokynoch a možno ich nájsť aj online.
Okrem vlnových dĺžok excitácie a emisie fluorescenčných sond je potrebné pri výbere filtračných blokov zvážiť aj to, či existuje nešpecifická excitácia a či existuje krížová farba pre viacfarebne označené vzorky. Okrem toho je potrebné zvážiť použitý zdroj žiarivkového svetla. V súčasnosti bežne používané fluorescenčné svetelné zdroje zahŕňajú ortuťové výbojky, metalhalogenidové výbojky a LED svetelné zdroje, ktoré sa v posledných rokoch rýchlo rozvíjali. Spektrum fluorescenčného svetelného zdroja je spojité alebo nespojité a energia sa bude líšiť v rôznych pásmach vlnových dĺžok. LED svetelný zdroj sa postupne stáva hlavným svetelným zdrojom fluorescenčného mikroskopu vďaka relatívne úzkemu spektrálnemu pásmu, stabilnejšiemu energetickému výkonu, dlhej životnosti, bezpečnejšej a ekologickejšej ochrane a mnohým ďalším výhodám.
Okrem vstavaného filtračného bloku mikroskopu je tu aj externé rýchle koliesko (obrázok 7). Rýchlosť konverzie filtra priľahlého k externému rýchlemu koliesku Leica je 27 ms, čo umožňuje realizovať vysokorýchlostné viacfarebné experimenty, ako je zobrazovanie vápnika s pomerom FRET a Fura2. (obr. 8) a kol.
Široká škála zobrazovacích techník fluorescenčnej mikroskopie
Aby sa splnili rôzne potreby fluorescenčného zobrazovania, okrem fluorescenčných mikroskopov boli vyvinuté rôzne zobrazovacie riešenia pre fluorescenčnú mikroskopiu:
Širokoúhlé zobrazovacie systémy s vysokým rozlíšením, ako je Leica THUNDER Imager, využívajú inovatívnu technológiu Clearing spoločnosti Leica na efektívne odstránenie signálov rušenia neohniskovej roviny počas zobrazovania, čím poskytujú čisté obrázky a výhody vysokorýchlostného zobrazovania;
Konfokálny laserový skenovací mikroskop využíva dierky na elimináciu interferencie v neohniskovej rovine, realizuje optické rezy a získava obrázky s vysokým rozlíšením a trojrozmerné obrázky;
Mikroskopy s ultravysokým rozlíšením a nanomikroskopy, ktoré prekračujú difrakčný limit, môžu pozorovať jemné štruktúry menšie ako 200 nm;
Multifotónový zobrazovací systém využívajúci princíp multifotónovej excitácie na zobrazenie hrubého tkaniva a hlboko in vivo;
Technológia zobrazovania svetelných listov s vysokým časovým a priestorovým rozlíšením, vysokou rýchlosťou zobrazovania, vysokým rozlíšením, nízkou fototoxicitou, zvlášť vhodná na výskum vývoja a dynamické pozorovanie in vivo;
Fluorescenčné celoživotné zobrazovanie (FLIM), ktoré nie je ovplyvnené faktormi, ako je koncentrácia fluorescenčnej látky, fotobielenie, intenzita excitačného svetla atď., môže vykonávať hlbšie funkčné a presnejšie merania;
Fluorescenčná korelačná spektroskopia (FCS) a fluorescenčná krížová korelačná spektroskopia (FCCS) merajú molekulové číslo a difúzny koeficient fluorescenčných molekúl, čím analyzujú molekulovú koncentráciu, veľkosť molekuly, viskozitu, molekulový pohyb, molekulovú väzbu/disociáciu a molekulové optické vlastnosti;
Totálna vnútorná reflexná fluorescenčná mikroskopia (TIRF) s extrémne vysokým rozlíšením osi z je ideálna na štúdium molekulárnej štruktúry a dynamiky povrchov bunkových membrán.
