Hlavnou pozorovacou metódou optického mikroskopu je fluorescenčné pozorovanie
Fluorescencia sa týka procesu, pri ktorom fluorescenčná látka takmer súčasne vyžaruje svetlo s dlhšou vlnovou dĺžkou, keď je ožiarená svetlom špecifickej vlnovej dĺžky (obrázok 1). Keď svetlo špecifickej vlnovej dĺžky (excitačná vlnová dĺžka) dopadá na molekulu, ako sú tie vo fluorofóre, fotónová energia je absorbovaná elektrónmi molekuly. Ďalej elektróny prechádzajú zo základného stavu (S0) do vyššej energetickej hladiny, excitovaného stavu (S1'). Tento proces sa nazýva excitácia①. Elektrón zostane v excitovanom stave 10-9–10-8 sekúnd, počas ktorých elektrón stratí určitú energiu②. Počas procesu opúšťania elektrónov z excitovaného stavu (S1) a návratu do základného stavu③ sa zvyšná energia absorbovaná počas procesu budenia uvoľňuje.
Doba zotrvania fluorescenčnej molekuly v excitovanom stave je životnosť fluorescencie, ktorá je vo všeobecnosti na úrovni nanosekúnd a je inherentnou charakteristikou samotnej fluorescenčnej molekuly. Fluorescencia Lifetime Imaging (FLIM), ktorá využíva technológiu fluorescenčného celoživotného zobrazovania, sa nazýva fluorescenčné celoživotné zobrazovanie (FLIM). Okrem zobrazovania intenzity fluorescencie možno získať hlbšie funkčné a presnejšie merania na získanie molekulárnej konformácie, medzimolekulových interakcií a mikroprostredia molekúl. Informácie, ktoré je ťažké získať konvenčným optickým zobrazovaním.
Ďalšou dôležitou vlastnosťou fluorescencie je Stokesov posun, rozdiel vo vlnovej dĺžke medzi excitačnými a emisnými vrcholmi (obrázok 2). Typicky je vlnová dĺžka emisie dlhšia ako vlnová dĺžka excitácie. Je to preto, že elektróny stratia časť svojej energie relaxačným procesom po excitácii fluorescenčnej látky a pred uvoľnením fotónov. Fluorescenčné látky s väčšími Stokesovými posunmi sú ľahšie pozorovateľné pod fluorescenčným mikroskopom.
Fluorescenčná mikroskopia a fluorescenčné filtračné kocky
Fluorescenčný mikroskop je optický mikroskop, ktorý využíva fluorescenčné vlastnosti na pozorovanie a zobrazovanie a je široko používaný v rôznych oblastiach, ako je bunková biológia, neurobiológia, botanika, mikrobiológia, patológia a genetika. Fluorescenčné zobrazovanie má výhody vysokej citlivosti a vysokej špecifickosti a je veľmi vhodné na pozorovanie distribúcie špecifických proteínov a organel v tkanivách a bunkách, štúdium kolokalizácie a interakcie, sledovanie životných dynamických procesov, ako sú zmeny koncentrácie iónov , atď.
Väčšina molekúl v bunkách nefluoreskuje a aby sme ich videli, musia byť fluorescenčne označené. Existuje mnoho metód fluorescenčného značenia, ako je priame značenie (ako je použitie DAPI na značenie DNA) alebo imunofarbenie využívajúce vlastnosti protilátok viažuce antigén alebo použitie fluorescenčných proteínov (ako je GFP, zelený fluorescenčný proteín) na značenie cieľových proteínov. a obojstranná väzba. Syntetické farbivá (napríklad Fura-2) atď.
V súčasnosti sa fluorescenčný mikroskop stal štandardným zobrazovacím zariadením rôznych laboratórií a zobrazovacích platforiem a je dobrým pomocníkom pre naše každodenné experimenty. Fluorescenčné mikroskopy sa delia hlavne do troch kategórií: vzpriamené fluorescenčné mikroskopy (vhodné na krájanie), inverzné fluorescenčné mikroskopy (vhodné pre živé bunky, berúc do úvahy krájanie), fluorescenčné stereoskopy (vhodné pre väčšie vzorky, ako sú rastliny, zebričky (dospelé/embryá). ), medaka, orgány myší/potkanov atď.).
Blok fluorescenčného filtra je základnou súčasťou mikroskopického fluorescenčného zobrazovania. Skladá sa z troch častí: budiaci filter, emisný filter a dichroický rozdeľovač lúčov. Je inštalovaný vo filtračnom kolese. Napríklad Leica DMi8 je vybavená 6-polohovým filtrovým kolieskom (obr. 3). Počet polôh rôznych koliesok mikroskopu sa bude líšiť a niektoré mikroskopy používajú sklíčka s filtračnými blokmi.
Blok filtra hrá dôležitú úlohu pri fluorescenčnom zobrazovaní: excitačný filter vyberá excitačné svetlo na excitáciu vzorky a blokuje svetlo iných vlnových dĺžok; svetlo prechádzajúce cez excitačný filter prechádza cez dichroické zrkadlo (jeho funkciou je odrážať excitačné svetlo a prenášať fluorescenciu), po odraze je zaostrené šošovkou objektívu, ožaruje vzorku a excituje zodpovedajúcu fluorescenciu, tj. , vyžarované svetlo. Vyžarované svetlo je zhromažďované šošovkou objektívu, prechádza cez dichroický rozdeľovač lúča a dosahuje emisný filter. Ako je znázornené na obrázku 4: excitačná vlnová dĺžka je 450-490 nm, dichroické zrkadlo odráža svetlo kratšie ako 510 nm, prenáša svetlo dlhšie ako 510 nm a rozsah príjmu emitovaného svetla je 520-560 nm.
