Princíp, charakteristika a použitie fluorescenčného mikroskopu
Princíp a štrukturálne charakteristiky fluorescenčného mikroskopu: fluorescenčný mikroskop využíva bodový svetelný zdroj s vysokou svetelnou účinnosťou na vyžarovanie určitej vlnovej dĺžky svetla (ako je ultrafialové svetlo 3650 palcov alebo fialové modré svetlo 4200 palcov) cez filtračný systém ako excitáciu svetlo na stimuláciu fluorescencie vo vzorke. Potom, čo látka vyžaruje fluorescenciu rôznych farieb, je pozorovaná prostredníctvom zväčšenia šošovky objektívu a okuláru. Týmto spôsobom, pod silným kontrastným pozadím, aj keď je fluorescencia veľmi slabá, je ľahko identifikovateľná a má vysokú citlivosť. Používa sa najmä na výskum bunkovej štruktúry a funkcie a chemického zloženia. Základná konštrukcia fluorescenčného mikroskopu sa skladá z bežného optického mikroskopu plus niektorého príslušenstva (ako je zdroj fluorescenčného svetla, excitačný filter, dvojfarebný rozdeľovač lúčov a blokovací filter atď.). Fluorescenčný zdroj svetla – vo všeobecnosti sa používa ultravysokotlaková ortuťová výbojka (50-200W), ktorá môže vyžarovať svetlo rôznych vlnových dĺžok, ale každá fluorescenčná látka má excitačnú vlnovú dĺžku, ktorá produkuje najsilnejšiu fluorescenciu, takže excitačný filter ( vo všeobecnosti existujú ultrafialové, fialové, modré a zelené excitačné filtre), ktoré prepúšťajú iba excitačné svetlo určitej vlnovej dĺžky a ožarujú vzorku, zatiaľ čo iné svetlo pohlcujú. Každá látka po ožiarení excitačným svetlom vyžaruje vo veľmi krátkom čase viditeľnú fluorescenciu s väčšou vlnovou dĺžkou ako je vlnová dĺžka ožiarenia. Fluorescencia je špecifická a vo všeobecnosti slabšia ako excitačné svetlo. Aby bolo možné pozorovať špecifickú fluorescenciu, je potrebný blokovací (alebo potláčací) filter za šošovkou objektívu.
Má dve funkcie: jednou je absorbovať a blokovať vstup excitačného svetla do okuláru, aby nedošlo k narušeniu fluorescencie a poškodeniu zraku; druhým je vybrať a nechať prejsť špecifickú fluorescenciu, pričom ukáže špecifickú fluorescenčnú farbu. Oba filtre sa musia používať spolu.
Existujú dva typy fluorescenčných mikroskopov z hľadiska ich optických dráh:
1. Transmisný fluorescenčný mikroskop: Zdroj excitačného svetla prechádza cez materiál vzorky cez kondenzorovú šošovku, aby sa excitovala fluorescencia. Bežne sa používa kolektor tmavého poľa a obyčajný kolektor možno použiť aj na nastavenie zrkadla tak, aby sa budiace svetlo presmerovalo a obišlo na preparát. Ide o starší fluorescenčný mikroskop. Výhodou je, že fluorescencia je pri malom zväčšení silná, nevýhodou však je, že so zvyšovaním zväčšenia fluorescencia klesá. Preto je lepšie pozorovať väčšie vzorky materiálov.
2. Epi-fluorescenčný mikroskop je nový typ fluorescenčného mikroskopu vyvinutý v modernej dobe. Rozdiel je v tom, že excitačné svetlo dopadá zo šošovky objektívu dole na povrch preparátu, to znamená, že rovnaká šošovka objektívu sa používa ako osvetľovací kondenzor a šošovka objektívu na zber fluorescencie. Do svetelnej dráhy, ktorá je vzdialená 45 stupňov od ľahkého uránu, je potrebné pridať dichroický rozdeľovač lúčov. Budiace svetlo sa odráža do šošovky objektívu a zachytáva sa na vzorke. Fluorescencia generovaná vzorkou a excitačné svetlo odrazené povrchom šošovky šošovky objektívu a povrchom krycieho skla vstupujú do šošovky objektívu súčasne a vracajú sa do dvojfarebného rozdeľovača lúčov, aby sa excitačné svetlo oddelilo od fluorescencie , zvyškové excitačné svetlo je absorbované blokovacími filtrami. Ako je zmena na kombináciu rôznych excitačných filtrov / dvojfarebného rozdeľovača lúčov / blokovacieho filtra, môže spĺňať potreby rôznych produktov fluorescenčnej reakcie. Výhodou tohto typu fluorescenčného mikroskopu je, že osvetlenie zorného poľa je rovnomerné, zobrazenie je jasné a čím väčšie zväčšenie, tým silnejšia je fluorescencia.
Ako používať fluorescenčný mikroskop
1. Zapnite zdroj svetla a ultravysokotlaková ortuťová výbojka sa musí niekoľko minút zahriať, aby dosiahla najjasnejší bod.
2. Transmisný fluorescenčný mikroskop musí nainštalovať požadovaný excitačný filter medzi zdroj svetla a kondenzor a za šošovku objektívu nainštalovať zodpovedajúci blokovací filter. Epifluorescenčné mikroskopy potrebujú vložiť požadovaný excitačný filter/dvojfarebný rozdeľovač lúčov/blokovacie filtre do štrbín v optickej dráhe.
3. Pozorujte objektívom s malým zväčšením a upravte stred svetelného zdroja tak, aby sa nachádzal v strede celého osvetľovacieho bodu podľa nastavovacieho zariadenia rôznych modelov fluorescenčných mikroskopov.
4. Umiestnite kus vzorky a po zaostrení pozorujte. Pri používaní je potrebné venovať pozornosť: nepozorujte priamo koncovým filtrom, aby ste nepoškodili zrak; pri pozorovaní vzoriek olejovou šošovkou musíte použiť špeciálnu olejovú šošovku bez fluorescencie; po vypnutí vysokotlakovej ortuťovej výbojky nie je možné ju ihneď znova zapnúť a je potrebné ju otestovať. Môže sa reštartovať po 5 minútach, inak bude nestabilná a ovplyvní životnosť ortuťovej výbojky.
