Dvojfotónová fluorescenčná mikroskopia má mnoho výhod
1) Svetlo s dlhou vlnovou dĺžkou je menej ovplyvnené rozptylom ako svetlo s krátkou vlnovou dĺžkou a môže ľahko preniknúť do vzorky;
2) Fluorescenčné molekuly mimo ohniskovej roviny nie sú excitované, čo umožňuje, aby sa do ohniskovej roviny dostalo viac excitačného svetla, čo umožňuje, aby excitačné svetlo preniklo hlbšie do vzoriek;
3) Blízke infračervené svetlo s dlhou vlnovou dĺžkou je pre bunky menej toxické ako svetlo s krátkou vlnovou dĺžkou;
4) Pri pozorovaní preparátov pomocou dvojfotónového mikroskopu dochádza k fotobieleniu a fototoxicite len v ohniskovej rovine. Preto sú dvojfotónové mikroskopy vhodnejšie ako jednofotónové mikroskopy na pozorovanie hrubých vzoriek, na pozorovanie živých buniek alebo na vykonávanie experimentov fotobielenia s pevným bodom.
Znalosti o konfokálnej fluorescenčnej mikroskopii
Základný princíp konfokálnej fluorescenčnej mikroskopie: Použite bodový svetelný zdroj na osvetlenie preparátu, aby sa vytvoril malý, dobre definovaný svetelný bod v ohniskovej rovine. Fluorescencia vyžarovaná škvrnou po osvetlení sa zachytáva šošovkou objektívu a vracia sa do dichroického zrkadla pozdĺž pôvodnej svetelnej dráhy osvetlenia. tvoria rozdeľovač lúčov. Spektrometer posiela fluorescenciu priamo do detektora. Pred svetelným zdrojom a detektorom je dierka, ktorá sa nazýva iluminačná dierka a detekčná dierka. Geometrické rozmery týchto dvoch sú konzistentné, približne 100-200 nm; vzhľadom na svetelný bod v ohniskovej rovine sú tieto dva konjugované, to znamená, že svetelný bod prechádza sériou šošoviek a nakoniec môže byť súčasne zaostrený na osvetľovaciu dierku a detekčnú dierku. Týmto spôsobom môže byť svetlo z ohniskovej roviny sústredené v detekčnom otvore, zatiaľ čo rozptýlené svetlo nad alebo pod ohniskovou rovinou je blokované mimo detekčného otvoru a nemožno ho zobraziť. Vzorka sa bod po bode naskenuje laserom a trubica fotonásobiča za detekčnou dierkou tiež získa konfokálny obraz zodpovedajúceho svetelného bodu bod po bode, ktorý sa prevedie na digitálny signál a prenesie do počítača a nakoniec sa agreguje. na obrazovke do jasného konfokálneho obrazu celej ohniskovej roviny. .
Každý obraz ohniskovej roviny je v skutočnosti optickým prierezom vzorky. Tento optický prierez má vždy určitú hrúbku a nazýva sa aj optický tenký prierez. Pretože intenzita svetla v ohnisku je oveľa väčšia ako intenzita svetla v neostrom a svetlo v neohniskovej rovine je filtrované dierkou, hĺbka ostrosti konfokálneho systému je približne nulová. Skenovanie pozdĺž smeru osi Z môže realizovať optickú tomografiu a vytvoriť požadovanú. Pozorujte dvojrozmerný optický rez na zaostrenom mieste vzorky. Kombináciou skenovania v rovine XY (ohnisková rovina) so skenovaním na osi Z (optická os), akumuláciou súvislých úrovní dvojrozmerných obrazov a ich spracovaním pomocou špecializovaného počítačového softvéru možno získať trojrozmerný obraz vzorky.
To znamená, že detekčná dierka a dierka svetelného zdroja sú vždy zaostrené na rovnaký bod, takže fluorescencia excitovaná mimo rovinu zaostrenia nemôže vstúpiť do detekčnej dierky.
Jednoduchým vyjadrením princípu fungovania laserového konfokálu je, že ako zdroj svetla používa laser. Na základe tradičného zobrazovania fluorescenčným mikroskopom sa pridáva laserové skenovacie zariadenie a konjugátové zaostrovacie zariadenie a systém je riadený počítačom na zber a spracovanie digitálnych obrazov.
