Dvojfotónová fluorescenčná mikroskopia má mnoho výhod:
1) Dlhšie vlnové dĺžky svetla sú menej ovplyvnené rozptylom ako kratšie vlnové dĺžky svetla na preniknutie do vzorky;
(2) Fluorescenčné molekuly mimo ohniskovej roviny nie sú excitované, takže viac excitačného svetla môže dosiahnuť ohniskovú rovinu, takže excitačné svetlo môže preniknúť hlbšie do vzorky;
3) Dlhšie vlnové dĺžky blízkeho infračerveného svetla sú pre bunky menej toxické ako kratšie vlnové dĺžky;
4) Pri použití dvojfotónového mikroskopu na pozorovanie preparátu sú fotobielenie a fototoxicita prítomné iba v ohniskovej rovine. Preto sú dvojfotónové mikroskopy vhodnejšie ako jednofotónové mikroskopy na pozorovanie hrubých vzoriek, na pozorovanie živých buniek alebo na vykonávanie experimentov bodového fotobielenia.
Znalosť konfokálneho fluorescenčného mikroskopu
Základný princíp konfokálneho fluorescenčného mikroskopu: na ožiarenie preparátu sa používa bodový svetelný zdroj, ktorý tvorí malý, dobre definovaný bod svetla v ohniskovej rovine. Fluorescencia emitovaná z tohto bodu po ožiarení sa zhromažďuje šošovkou objektívu a posiela sa späť do rozdeľovača lúčov, ktorý pozostáva z obojsmerného chromatického zrkadla pozdĺž pôvodnej svetelnej dráhy ožiarenia. Rozdeľovač lúčov posiela fluorescenciu priamo do detektora. Svetelný zdroj aj detektor majú pred sebou dierku, ktorá sa nazýva iluminačná dierka a detekčná dierka. Obidve majú rovnakú geometriu, približne 100-200 nm, a sú konjugované vzhľadom na bod svetla v ohniskovej rovine, tj bod svetla prechádza sériou šošoviek a v konečnom dôsledku môže byť zaostrený na obe osvetľovacie a detektorové dierky. Týmto spôsobom sa svetlo z ohniskovej roviny môže zbiehať v apertúre sondy, zatiaľ čo rozptýlené svetlo zhora alebo pod ohniskovou rovinou je blokované mimo apertúry sondy a nemožno ho zobraziť. Laser skenuje vzorku bod po bode a trubica fotonásobiča po detekcii dierky získa aj konfokálny obraz zodpovedajúceho svetelného bodu bod po bode, ktorý sa prevedie na digitálny signál a prenesie do počítača a nakoniec sa zblíži do čistého konfokálny obraz celej ohniskovej roviny na obrazovke.
Každý obraz ohniskovej roviny je v skutočnosti optickým prierezom vzorky a tento optický prierez má vždy určitú hrúbku, tiež známu ako optická fólia. Keďže intenzita svetla v ohniskovom bode je oveľa väčšia ako v neohniskovom bode a svetlo v neohniskovej rovine je odfiltrované dierkou, hĺbka poľa konfokálneho systému je aproximovaná na nulu a skenovanie pozdĺž smeru osi Z umožňuje optickej tomografii vytvoriť dvojrozmerný optický rez vzorky, ktorý sa má pozorovať v ohnisku. Kombináciou skenovania v rovine XY (ohnisková rovina) so skenovaním na osi Z (optická os) je možné získať trojrozmerný obraz vzorky akumuláciou postupných vrstiev dvojrozmerných obrazov, ktoré sú spracované špecializovaným počítačovým softvérom.
To znamená, že detekčná dierka a dierka svetelného zdroja sú vždy zaostrené na rovnaký bod, takže fluorescencia excitovaná mimo ohniskovej roviny nemôže vstúpiť do detekčnej dierky.
Pracovný princíp laserového konfokálu je jednoducho vyjadrený tak, že používa laser ako zdroj svetla na základe tradičného zobrazovania fluorescenčným mikroskopom, prídavného laserového skenovacieho zariadenia a konjugovaného zaostrovacieho zariadenia prostredníctvom počítačového riadenia na vykonávanie digitálneho systému získavania a spracovania obrazu.
