Aplikácia fluorescenčnej fluorescenčnej mikroskopie s úplným vnútorným odrazom
TIRFM (Total Internal Reflection Fluorescence Microscope), totálny vnútorný reflexný fluorescenčný mikroskop, keď svetlo vstupuje do média s nižším indexom lomu z média s vysokým indexom lomu, ak je uhol dopadu dostatočne veľký, všetko svetlo sa odráža bez lomu, ale v Rozhranie dvoch médií vytvára evanescentné vlny, ktoré môžu excitovať fluorescenciu do 100 nm blízko rozhrania, aby sa realizovalo pozorovanie povrchu objektu. Budiace svetlo môže byť vysielané cez iluminátor bežného fluorescenčného mikroskopu alebo špeciálny iluminátor a môže byť kontrolovaný uhol dopadu lasera. Metóda okamžitého budenia poľa sa používa na zabránenie vstupu excitačného svetla do detektora. Budiace svetlo na rozhraní medzi sklom a vodou vytvára plné vnútro realizované odrazom. V dôsledku exponenciálneho zoslabenia excitačného svetla bude fluorescenčný odraz produkovať iba oblasť vzorky veľmi blízko k úplnému odrazovému povrchu, čo výrazne znižuje interferenciu hluku pozadia s cieľom pozorovania, takže táto technológia je široko používaná pri dynamickom pozorovaní. látok na povrchu buniek.
Schematický diagram totálnej internej reflexnej fluorescenčnej mikroskopie (TIRFM)
①Ukážka ②Rozsah evanescentných vĺn ③Krycie sklo ④Ponor do oleja ⑤Cieľ ⑥Emisný lúč (signál) ⑦Budiaci lúč
Aby sa dosiahol úplný vnútorný odraz, je potrebný veľký uhol dopadu, napríklad uhol dopadu na rozhraní sklo-voda je väčší ako 61 stupňov. Dá sa to dosiahnuť hranolom nazývaným TIRFM na báze hranola alebo šošovkou objektívu s vysokou numerickou apertúrou, ktorá sa nazýva TIRFM objektívového typu. Súčasné komercializované totálne interné reflexné fluorescenčné mikroskopy sú vo všeobecnosti typu objektívu s vysokou rýchlosťou a vysokou presnosťou.
Totálna vnútorná reflexná fluorescenčná mikroskopia je široko používaná v niektorých biologických oblastiach, pretože dokáže realizovať fluorescenčné pozorovanie vo veľmi tenkom rozsahu (menej ako 100 nm) na povrchu predmetov. Ako napríklad nasledujúce aplikácie:
Pozorovanie obrazov bunkového povrchu: štruktúra povrchu bunkovej membrány, kontakt s bunkovým povrchom, dynamika povrchu membrány/lokalizácia proteínov.
Pozorovanie a manipulácia s jednou molekulou: myozín, aktín a Cy3-označený ATP.
Pohyb povrchu bunkovej membrány: ako je pohltenie vezikúl, výdych vezikúl a exokrinné vezikuly. a
Pozorovanie javu vápnikového iskrenia v bunkovej membráne, monitorovanie iónových kanálov.
Molekulárny motorický výskum: rotačné motory, cytoskeletálne proteíny, polyméry, G proteíny, kruhové proteíny, nukleotidové motory.
Okrem oblasti biológie má dobré uplatnenie aj v oblasti chémie na pozorovanie chemických molekulárnych štruktúr.
