Rozdiely a výhody a nevýhody medzi transmisnou fluorescenčnou mikroskopiou a reflexnou fluorescenčnou mikroskopiou
1. Transmisný fluorescenčný mikroskop: Zdroj excitačného svetla prechádza cez materiál vzorky cez kondenzor, aby sa excitovala fluorescencia. Bežne používané koncentrátory tmavého poľa alebo bežné koncentrátory možno použiť na nastavenie reflektora na premenu excitačného svetla a bočného svetla na vzorku. Ide o relatívne staromódny fluorescenčný mikroskop. Jeho výhodou je silná fluorescencia pri malom zväčšení, nevýhodou je, že jeho fluorescencia s rastúcim zväčšením slabne. Preto je lepšie na pozorovanie väčších vzoriek materiálov.
2. Fluorescenčný mikroskop s padajúcim lúčom: Ide o nový typ fluorescenčného mikroskopu, ktorý sa vyvinul v modernej dobe. Na rozdiel od predchádzajúceho dopadá excitačné svetlo zo šošovky objektívu na povrch preparátu, pričom sa používa rovnaká šošovka objektívu ako osvetľovací kondenzor a šošovka objektívu na zber fluorescencie. K optickej dráhe je potrebné pridať dvojfarebný oddeľovač lúčov, ktorý tvorí s fotouránom uhol 45 stupňov. Budiace svetlo sa odráža do šošovky objektívu a zhromažďuje sa na vzorke. Fluorescencia generovaná vzorkou a excitačné svetlo odrazené od povrchu šošovky objektívu a krycieho skla súčasne vstupujú do šošovky objektívu a vracajú sa do dvojfarebného separátora lúčov, čím sa oddeľuje excitačné svetlo a fluorescencia. Zvyškové excitačné svetlo je potom absorbované blokovacím filtrom. Ak sa použijú rôzne kombinácie excitačných filtrov, dvojfarebných lúčových separátorov a blokovacích filtrov, môžu spĺňať potreby rôznych fluorescenčných reakčných produktov. Výhody tohto fluorescenčného mikroskopu sú rovnomerné osvetlenie zorného poľa, jasné zobrazenie a silnejšia fluorescencia s väčším zväčšením.
Výhody a nevýhody transmisnej fluorescenčnej mikroskopie
Svetelný zdroj: Vysokotlaková ortuťová alebo halogénová žiarovka.
Zrkadlo bodového svetla: Použitie bodového svetla v tmavom poli na oddelenie excitácie a fluorescencie.
Objektív: Je možné použiť akýkoľvek typ objektívu.
Vzorka: Na transmisné pozorovanie sú vhodnejšie tenké vzorky.
Výhody: ① Vďaka použitiu kondenzora tmavého poľa sa excitačné svetlo nemôže dostať do šošovky objektívu, čo uľahčuje vytvorenie tmavého pozadia a dosiahnutie dobrého kontrastu a na pozorovanie možno použiť akúkoľvek šošovku objektívu. ② Pri použití objektívu s nízkym zväčšením je jasnejší ako reflexný fluorescenčný mikroskop.
Nevýhoda: Stred a výška reflektora musia byť správne nastavené, inak nie je možné získať jasný fluorescenčný obraz. Z dôvodu obmedzenia ohniskovej vzdialenosti bodového svetla tmavého poľa nemožno použiť hrubé sklenené diapozitívy. Osvetlená plocha zorného poľa by nemala byť príliš veľká, inak môže spôsobiť vyblednutie fluorescenčnej farby fluorescenčnej vzorky. Hrubé alebo nepriehľadné vzorky nie sú vhodné.
Výhody a nevýhody reflexnej fluorescenčnej mikroskopie
Svetelný zdroj: Vysokotlaková ortuťová alebo halogénová žiarovka.
Zaostrovacia šošovka: Keďže šošovka objektívu slúži ako zaostrovacia šošovka, nie je potrebná zaostrovacia šošovka.
Objektív: Použitý objektív musí byť schopný prenášať dostatočné množstvo ultrafialového svetla a nesmie sám produkovať fluorescenciu, bez obmedzenia numerickej apertúry.
Vzorka: Je možné pozorovať hrubé aj nepriehľadné vzorky.
Výhody: ① Keďže šošovka objektívu slúži aj ako reflektor, nevyžaduje veľké nastavovanie. ② Použitím metódy osvetlenia Kolar je možné využiť účinky clony a clony zorného poľa Numerická apertúra šošovky objektívu nie je obmedzená a snímky s vysokým rozlíšením možno získať aj pri veľkom zväčšení Hrubé alebo nepriehľadné vzorky pozorované a možno použiť aj hrubé krycie sklíčka S odrazenou fluorescenciou je možné kombinovať aj iné pozorovacie metódy, najmä s metódou fázového rozdielu a metódou prenosovej diferenciálnej interferencie. Môže sa tak vyhnúť zbytočnému javu vyblednutia farby fluorescencie.
Nevýhoda: Pri použití objektívu so zemným zväčšením je obraz pomerne tmavý, preto je potrebné použiť objektív s vysokou numerickou apertúrou. Filtračný systém musí účinne oddeľovať excitačnú luminiscenciu a fluorescenciu.,
