Rozdiely a charakteristiky medzi fluorescenčnými mikroskopmi a bežnými optickými mikroskopmi
Fluorescenčný mikroskop sa líši od bežného optického mikroskopu v tom, že nepozoruje vzorky pri osvetlení bežnými svetelnými zdrojmi. Namiesto toho používa určitú vlnovú dĺžku svetla (zvyčajne ultrafialové svetlo, modrofialové svetlo) na excitáciu fluorescenčných látok vo vnútri vzorky pod mikroskopom, čo spôsobuje, že emitujú fluorescenciu. Preto úlohou svetelného zdroja vo fluorescenčnom mikroskope nie je priame osvetlenie, ale ako zdroj energie na excitáciu fluorescenčných látok vo vnútri vzorky. Dôvodom, prečo môžeme vzorky pozorovať, nie je osvetlenie zdroja svetla, ale fenomén fluorescencie, ktorý vykazujú fluorescenčné látky vo vnútri vzorky po absorpcii excitovanej svetelnej energie. Z toho je vidieť, že charakteristikou fluorescenčnej mikroskopie je najmä to, že jej svetelný zdroj dokáže dodať veľké množstvo excitačného svetla v špecifickom rozsahu vlnových dĺžok, takže fluorescenčné látky vo vzorke môžu získať potrebnú intenzitu excitačného svetla. Zároveň musia mať fluorescenčné mikroskopy zodpovedajúce filtračné systémy. Fluorescenčný mikroskop je základným nástrojom fluorescenčnej tkanivovej chémie. Skladá sa z hlavných komponentov, ako je ultra-vysokonapäťový svetelný zdroj, filtračný systém (vrátane excitačných a potlačovacích filtračných platní), optický systém a fotografický systém. Využíva svetlo určitej vlnovej dĺžky na excitáciu vzorky a vyžarovanie fluorescencie.
1. Metódy fluorescenčnej excitácie: Podľa rozsahu vlnových dĺžok svetla existujú dva typy: UV excitačná metóda (pomocou ultrafialového osvetlenia) a BV excitačná metóda (pomocou modrého fialového svetla). Metóda UV excitácie využíva na excitáciu blízke ultrafialové svetlo kratšie ako 400 nm. Táto metóda nemá viditeľné excitačné svetlo, takže pozorovaná fluorescencia vykazuje inherentnú fluorescenciu farbiva, čo uľahčuje odlíšenie špecifickej fluorescencie na vzorke od vlastnej fluorescencie tkaniva pozadia.
2. Metóda BV excitácie: Zahŕňa excitáciu z ultrafialového na modré svetlo so stredom pri 404nm a 434nm. Táto metóda využíva modré svetlo na ožarovanie preparátu, takže cut{4}}filter fluorescenčného pozorovacieho systému musí používať filter, ktorý dokáže úplne blokovať modré svetlo a úplne prejsť cez požadovanú zelenú a žltú fluorescenciu. Fluorescenčné pigmenty používané na fluorescenčnú protilátkovú metódu. Maximálna absorpčná vlnová dĺžka excitačného svetla a maximálna emisná vlnová dĺžka fluorescencie sú relatívne blízko, takže filter používaný v BV excitačnej metóde musí používať filter s ostrým rezom. Táto metóda môže používať modré svetlo ako excitačné svetlo, takže absorpčná účinnosť fluorescenčných pigmentov je vysoká a možno získať jasnejšie obrázky. Nevýhodou je, že fluorescenciu pod 500 nm nie je možné vidieť, zatiaľ čo fluorescencia nad 500 nm spôsobí, že sa celý obraz javí žltý. Pri fluorescenčnej protilátkovej metóde je špecifickosť väčšinou určená farbou jedinečnou pre fluorescenčné pigmenty, takže pri diskusii o jemnej špecifickosti majú nevýhody BV excitačnej metódy uvedené vyššie často významný vplyv.
