Poznatky súvisiace s konfokálnou fluorescenčnou mikroskopiou
Základným princípom konfokálnej fluorescenčnej mikroskopie je použitie bodového svetelného zdroja na ožiarenie preparátu, čím sa vytvorí dobre definovaný malý bod v ohniskovej rovine. Fluorescencia vyžarovaná škvrnou po ožiarení sa zachytáva šošovkou objektívu a posiela sa späť do spektrofotometra zloženého z obojsmerného farebného zrkadla pozdĺž pôvodnej dráhy ožiarenia. Spektrofotometer posiela fluorescenciu priamo do detektora. Pred zdrojom svetla a detektorom sú dve dierky, ktoré sa nazývajú osvetľovacie dierky a detekčné dierky. Geometrické rozmery týchto dvoch sú konzistentné, približne 100-200 nm; V porovnaní so svetelným bodom v ohniskovej rovine sú tieto dva konjugované, čo znamená, že svetelný bod prechádza sériou šošoviek a nakoniec sa môže súčasne sústrediť na osvetľovaciu dierku aj na detekčnú dierku. Týmto spôsobom sa svetlo z ohniskovej roviny môže zbiehať v dosahu detekčného otvoru, zatiaľ čo rozptýlené svetlo nad alebo pod ohniskovou rovinou je blokované mimo detekčného otvoru a nemožno ho zobraziť. Skenovaním vzorky bod po bode laserom získa trubica fotonásobiča po detekcii dierky aj zodpovedajúci konfokálny obraz svetelného bodu bod po bode, ktorý sa prevedie na digitálny signál a prenesie do počítača. Nakoniec sa na obrazovke syntetizuje jasný konfokálny obraz celej ohniskovej roviny.
Každý obraz ohniskovej roviny je v skutočnosti optickým prierezom preparátu, ktorý má vždy určitú hrúbku, tiež známu ako optický tenký rez. Vzhľadom na skutočnosť, že intenzita svetla v ohniskovom bode je oveľa väčšia ako v neohniskovom bode a svetlo mimo ohniskovej roviny je odfiltrované dierkami, je hĺbka ostrosti konfokálneho systému približne nulová. Skenovaním pozdĺž smeru osi Z sa dá dosiahnuť optická tomografia, ktorá vytvorí dvojrozmerný optický rez v ohnisku pozorovanej vzorky. Kombináciou skenovania v rovine XY (ohnisková rovina) so skenovaním na osi Z (optická os) možno získať trojrozmerný obraz vzorky nahromadením súvislých vrstiev dvojrozmerných obrazov a ich spracovaním pomocou špecializovaného počítačového softvéru.
Detekčná dierka a dierka svetelného zdroja sú vždy zaostrené na rovnaký bod, takže fluorescencia excitovaná mimo rovinu zaostrovania nemôže vstúpiť do detekčnej dierky.
Jednoduchým vyjadrením princípu fungovania laserovej konfokálnej mikroskopie je, že ako zdroj svetla používa laser a pridáva laserové skenovacie zariadenie a konjugované zaostrovacie zariadenie na báze tradičného zobrazovania fluorescenčnou mikroskopiou. Ide o systém riadený počítačom na digitálne získavanie a spracovanie obrazu.
