Nízkonákladový dizajn mikroskopu s fluorescenciou a jasným poľom
Fluorescenčná mikroskopia je metóda používaná na vizualizáciu
V tejto príručke preskúmam základy fluorescenčnej mikroskopie a ako zostaviť tri rôzne lacné fluorescenčné mikroskopy. Tieto systémy zvyčajne stoja tisíce dolárov, no v poslednom čase sa vyskytli snahy o ich lepšiu dostupnosť. Návrhy, ktoré tu uvádzam, používajú smartfón, dSLR a USB mikroskop. Všetky tieto konštrukcie možno použiť aj ako mikroskopy s jasným poľom.
Krok 1: Prehľad fluorescenčnej mikroskopie
Aby ste pochopili základné pojmy fluorescenčnej mikroskopie, predstavte si hustý les v noci so stromami, zvieratami, kríkmi a inými živými lesmi. Ak zasvietite baterkou do lesa, uvidíte všetky tieto štruktúry a budete mať problém predstaviť si konkrétne zvieratá alebo rastliny. Predpokladajme, že máte záujem vidieť len čučoriedkové kríky v lese. K tomu cvičíte svetlušku, aby ju prilákali iba kríky čučoriedok, aby sa pri pohľade na les rozsvietili iba kríky čučoriedok. Dalo by sa povedať, že svetluškami označujete kríky čučoriedok, aby ste v lese videli čučoriedkové štruktúry.
V tejto analógii les predstavuje celú vzorku, čučoriedkové kríky predstavujú štruktúry, ktoré chcete zobraziť (napr. špecifické bunky alebo subcelulárne organely) a svetlušky sú fluorescenčné zlúčeniny. Samotné osvetlenie baterky bez svetlušiek je podobné mikroskopii v jasnom poli.
Ďalším krokom je pochopenie základnej funkcie fluorescenčných zlúčenín (známych aj ako fluorofóry). Fluorofóry sú vlastne malé objekty (nanorozmery) určené na spojenie špecifických štruktúr vo vzorke. Absorbujú úzky rozsah vlnových dĺžok svetla a znovu vyžarujú inú vlnovú dĺžku svetla. Napríklad fluorofór môže absorbovať modré svetlo (tj fluorofór je excitovaný modrým svetlom) a potom znovu vyžarovať zelené svetlo. Toto je zvyčajne zhrnuté excitačným a emisným spektrom (vyššie). Tieto diagramy ukazujú vlnovú dĺžku svetla absorbovaného fluorofórom a vlnovú dĺžku svetla emitovaného fluorofórom.
Konštrukcia mikroskopu je veľmi podobná konštrukcii bežného mikroskopu v jasnom poli s dvoma hlavnými rozdielmi. Po prvé, svetlo osvetľujúce vzorku musí mať vlnovú dĺžku, ktorá excituje fluorofór (pre príklad vyššie je svetlo modré). Po druhé, mikroskop potrebuje iba zbierať vyžarované svetlo (zelené svetlo), pričom blokuje modré svetlo. Je to preto, že modré svetlo je všade, ale zelené svetlo pochádza len zo špecifických štruktúr vo vzorke. Na blokovanie modrého svetla majú mikroskopy zvyčajne niečo, čo sa nazýva dlhopriepustný filter, ktorý prepúšťa zelené svetlo bez modrého svetla. Každý dlhopriepustný filter má hraničnú vlnovú dĺžku. Ak má svetlo vlnovú dĺžku dlhšiu ako je medzná vlnová dĺžka, môže prejsť cez filter. Odtiaľ pochádza názov „long pass“. Kratšie vlnové dĺžky sú blokované.
Krok 2: Modelovanie mikroskopu optickou optikou
Toto je ďalší krok k základným princípom konštrukcie mikroskopu. Nie je potrebné stavať fluorescenčný mikroskop, takže ak sa nechcete vŕtať v optike, môžete ho vynechať.
Mikroskopy vo svetlom poli aj fluorescenčné mikroskopy možno modelovať pomocou lúčovej optiky. Základným predpokladom lúčovej optiky je, že svetlo sa správa podobne ako svetlo, ktoré sa vzďaľuje od svetelného zdroja. Keď sa rozhliadnete po miestnosti, vidíte svetlo zo slnečného svetla za oknom alebo zo žiarovky. Svetlo je potom absorbované alebo odrazené predmetmi v miestnosti. Časť odrazeného svetla spôsobuje, že je nasmerované k vašim očiam. Ak je objekt osvetlený, môžete si predstaviť, že každý bod na objekte vyžaruje svetlo vo všetkých smeroch (hore). Šošovka, podobne ako šošovka v našich očiach, sústreďuje svetlo do bodu, aby sme mohli objekt vidieť. Bez šošovky sa svetlo ďalej pohybuje smerom von a nevytvára obraz.
Ako teda vyrábame optické systémy, ktoré zväčšujú malé predmety? Aby ste pochopili dizajn, potrebujete poznať iba dve rovnice: rovnice zobrazovania tenkých šošoviek a rovnice zväčšenia:
1/f=1/si + 1/tak
M=-si/tak
f je ohnisková vzdialenosť šošovky. Kratšia ohnisková vzdialenosť znamená, že objektív má väčšiu ostrosť.
To isté platí pre vzdialenosť objektu; vzdialenosť medzi šošovkou a objektom (napr. stromom).
si je vzdialenosť obrazu; vzdialenosť medzi šošovkou a miestom, kde sa vytvára obraz
M je zväčšenie; aký veľký je obrázok vzhľadom na objekt. Pri mikroskopoch chceme zvýšiť zväčšenie.
Úplný návod na rovnicu tenkých šošoviek nájdete v tomto videu Khan Academia. Na obrázku vyššie môžete vidieť, že vzdialenosť, o ktorú sa objekt priblíži k objektívu, zväčšuje vzdialenosť obrázka, čím sa zvyšuje zväčšenie. Vertikálna čiara s dvoma šípkami označuje objektív.
