Mikroskopická klasifikácia a princíp fungovania pre bunkový výskum
Mikroskop je primárnym nástrojom na pozorovanie buniek. Podľa rôznych svetelných zdrojov ho možno rozdeliť do dvoch kategórií: optické mikroskopy a elektrónové mikroskopy. Prvý používa ako zdroj svetla viditeľné svetlo (UV mikroskopy používajú ultrafialové svetlo), zatiaľ čo druhý používa ako zdroj svetla elektrónové lúče.
-,Optický mikroskop
(1) Bežný optický mikroskop
Bežné biologické mikroskopy sa skladajú z troch častí, a to: ① osvetľovací systém vrátane svetelného zdroja a kondenzora; ② optický zväčšovací systém, zložený z objektívu a okuláru, ktorý je hlavným telom mikroskopu. Aby sa eliminovala sférická a chromatická aberácia, okulár aj objektív ③Mechanické zariadenie, ktoré sa používa na fixáciu materiálu a uľahčenie pozorovania (obrázok 2-1).
O tom, či je obraz mikroskopu jasný, nerozhoduje len zväčšenie, ale súvisí aj s rozlišovacou schopnosťou mikroskopu. Rozlíšenie sa vzťahuje na schopnosť mikroskopu (alebo ľudského oka byť 25 cm od cieľa) rozlíšiť najmenšiu vzdialenosť medzi objektmi. Veľkosť rozlíšenia je určená pomerom vlnových dĺžok a apertúry svetla a index lomu média sú vyjadrené vzorcom:
Vo vzorci: n=index lomu média;=uhol clony (uhol otvorenia preparátu k clone šošovky objektívu), NA=clona šošovky (numerická clona). Uhol šošovky je vždy menší ako 180 stupňov, takže maximálna hodnota sina/2 musí byť menšia ako 1.
Index lomu skla použitého na výrobu optickej šošovky je 1,65 až 1,78 a index lomu použitého média je bližšie k sklu, tým lepšie. Pre suché objektívy je médiom vzduch a pomer clony objektívu je vo všeobecnosti 0.05 až 0,95; pre olejové šošovky sa ako médium používa cédrový olej a pomer clony objektívu sa môže blížiť k 1,5.
Vlnová dĺžka bežného svetla je {{0}}nm, takže hodnota rozlíšenia mikroskopu nebude menšia ako 0,2μm a rozlíšenie ľudského oka je 0,2 mm, takže maximálne zväčšenie všeobecnej konštrukcie mikroskopu je zvyčajne 1000X.
(2) Fluorescenčná mikroskopia
Niektoré látky v bunkách, ako napríklad chlorofyl, môžu po ožiarení ultrafialovými lúčmi fluoreskovať; niektoré látky samotné fluoreskovať nedokážu, ale ak sú zafarbené fluorescenčnými farbivami alebo fluorescenčnými protilátkami, môžu fluoreskovať aj pri ožiarení ultrafialovými lúčmi a fluorescenčný mikroskop (obr. 2-2, 3, 4) je jedným z nástrojov na kvalitatívny a kvantitatívny výskum takýchto látok.
Fluorescenčné mikroskopy a bežné mikroskopy majú tieto rozdiely:
1. Metóda osvetlenia je zvyčajne epiiluminácia, to znamená, že zdroj svetla sa premieta na vzorku cez šošovku objektívu (obrázok 2-3);
2. Zdrojom svetla je ultrafialové svetlo, vlnová dĺžka je kratšia a rozlíšenie je vyššie ako u bežných mikroskopov;
3. Existujú dva špeciálne filtre, jeden pred zdrojom svetla sa používa na odfiltrovanie viditeľného svetla a jeden medzi okulárom a šošovkou objektívu sa používa na odfiltrovanie ultrafialového svetla na ochranu očí.
(3) Laserový skenovací konfokálny mikroskop
Laserový konfokálny skenovací mikroskop (laserový konfokálny skenovací mikroskop, obrázok 2-5, 6) využíva laser ako skenovací zdroj svetla a skenuje zobrazovanie bod po bode, riadok po riadku, povrch po povrchu a skenovací laser a zbierka fluorescencie zdieľajú šošovka objektívu a ohnisko šošovky objektívu je Ohniskový bod skenovacieho lasera je zároveň aj objektovým bodom okamžitého zobrazovania. Pretože vlnová dĺžka laserového lúča je krátka a lúč je veľmi tenký, má konfokálny laserový skenovací mikroskop vyššie rozlíšenie, ktoré je asi 3-krát väčšie ako u bežného optického mikroskopu. Systém je zaostrený raz a skenovanie je obmedzené na jednu rovinu vzorky. Keď je hĺbka zaostrenia iná, možno získať obrázky rôznych úrovní hĺbky vzorky. Tieto obrazové informácie sú uložené v počítači. Pomocou počítačovej analýzy a simulácie je možné zobraziť trojrozmernú štruktúru vzorky buniek.
Konfokálna laserová skenovacia mikroskopia môže byť použitá nielen na pozorovanie morfológie buniek, ale aj na kvantitatívnu analýzu intracelulárnych biochemických zložiek, štatistiku optickej hustoty a meranie morfológie buniek.
(4) Mikroskop v tmavom poli
Mikroskop v tmavom poli (mikroskop s tmavým poľom, obrázok 2-7) má v strede kondenzora svetlú dosku, takže osvetľovacie svetlo nevstupuje priamo do ľudskej šošovky a iba svetlo odrazené a ohýbané vzorkou je povolený vstup do šošovky objektívu, takže pozadie zorného poľa je čierne, okraje objektov sú svetlé. Pomocou tohto mikroskopu je možné vidieť častice už od 4-200 nm a rozlíšenie môže byť 50-krát vyššie ako u bežných mikroskopov.
(5) Mikroskop s fázovým kontrastom
Fázový kontrastný mikroskop (phasecontrast microscope, Obrázok 2-8, 9) od P. Zernikeho bol vynájdený v roku 1932 a v roku 1953 zaň získal Nobelovu cenu za fyziku. Najväčšou vlastnosťou tohto mikroskopu je, že dokáže pozorovať nezafarbené vzorky a živé bunky.
Základným princípom mikroskopie s fázovým kontrastom je zmeniť rozdiel optickej dráhy viditeľného svetla prechádzajúceho vzorkou na rozdiel amplitúdy, čím sa zlepší kontrast medzi rôznymi štruktúrami a rôzne štruktúry budú jasne viditeľné. Po prechode cez preparát sa svetlo láme, odchyľuje od pôvodnej optickej dráhy a oneskoruje sa o 1/4λ (vlnová dĺžka). Zosilnenie, zvýšenie alebo zníženie amplitúdy, zvýšenie kontrastu. Z hľadiska štruktúry majú mikroskopy s fázovým kontrastom dve špeciálne vlastnosti, ktoré sa líšia od bežných optických mikroskopov:
1. Prstencová clona je umiestnená medzi zdrojom svetla a kondenzorom a jej funkciou je, aby svetlo prechádzajúce cez kondenzor vytvorilo dutý svetelný kužeľ a zaostrilo sa na preparát.
2. Fázová platňa (prstencová fázová platňa) pridáva fázovú platňu potiahnutú fluoridom horečnatým v šošovke objektívu, ktorá môže oneskoriť fázu priameho svetla alebo difraktovaného svetla o 1/4λ. Existujú dva typy:
①A plus fázová doska: Priame svetlo je oneskorené o 1/4λ. Po spojení dvoch skupín svetelných vĺn sa svetelné vlny sčítajú a amplitúda sa zvýši. Štruktúra vzorky je jasnejšia ako okolité médium a vytvára jasný kontrast (alebo negatívny kontrast).
② B plus fázová platňa: Difraktované svetlo je oneskorené o 1/4λ. Po spojení dvoch sád lúčov sa svetelné vlny odpočítajú a amplitúda sa zmenší, čím sa vytvorí tmavý kontrast (alebo pozitívny kontrast) a štruktúra je tmavšia ako okolité médium.
(6) Polarizačný mikroskop
Polarizačný mikroskop sa používa na detekciu látok s dvojlomom, ako sú vlákna, vretienka, kolagén, chromozómy a pod. Rozdiel oproti bežným mikroskopom je v tom, že pred zdrojom svetla je polarizátor (polarizátor), takže svetlo vstupujúce do mikroskopu je polarizované svetlo, a v ňom je analyzátor (polarizátor, ktorého smer polarizácie je kolmý na polarizátor). tubus objektívu. Stolík tohto mikroskopu sa dá otáčať. Keď je na stolík umiestnená jednorefrakčná látka, bez ohľadu na to, ako sa stolík otáča, keďže dva polarizátory sú vertikálne, v mikroskope nie je vidieť žiadne svetlo a svetlo nie je viditeľné v mikroskope. Pri vstupe do dvojlomných materiálov môže rotačný stupeň detekovať takéto predmety, pretože svetlo sa pri prechode cez takéto materiály odchyľuje.
