Optické vlastnosti biologických mikroskopov
Optický výkon mikroskopu je určený nasledujúcimi ôsmimi základnými optickými parametrami (alebo parametrami):
(1) Numerická clona
Numerická clona sa tiež nazýva zrkadlový pomer. Vzťahuje sa na súčin indexu lomu n média medzi pozorovaným objektom a šošovkou a sínusovej hodnoty polovice uhla šošovky objektívu. Na reprezentáciu použite NA alebo A. NA=nsin( /2)
Takzvaný uhol ústia zrkadla sa vzťahuje na uhol medzi okrajovými lúčmi pozorovaného bodu vstupujúcich do prednej šošovky šošovky objektívu.
Číselná apertúra je dôležitým parametrom šošovky objektívu a kondenzorovej šošovky a úzko súvisí s ostatnými optickými parametrami mikroskopu. Všeobecne sa verí, že čím väčšie, tým lepšie. Zo vzorca je zrejmé, že existujú dva spôsoby, ako zvýšiť numerickú apertúru, jedným je zväčšiť uhol ústia zrkadla a druhým je zvýšenie indexu lomu medzi šošovkou objektívu a vzorkou.
Keď sa použije predchádzajúca metóda, vzorka a objekt môžu byť čo najbližšie k sebe. Ale bez ohľadu na to, ako blízko, je vždy menej ako 180 stupňov . Teda sin( /2) je tiež menšie ako 1. Index lomu vzduchu je n=1. Preto je numerická apertúra nsin( /2) suchej šošovky objektívu vždy menšia ako 1, vo všeobecnosti medzi 0,04 a 0,95.
Keď sa použije druhý spôsob, medzi šošovku objektívu a preparát možno pridať médium s vyšším indexom lomu. Napríklad index lomu cédrového oleja je n=1,515. Keď sa ako médium použije cédrový olej, numerická apertúra môže dosiahnuť viac ako 1,2. Preto sa v niektorých prípadoch používajú okuliare na olej. V súčasnosti je maximálna numerická clona, ktorú môže olejový objektív dosiahnuť, 1,4.
(2) Uznesenie
Rozlíšenie sa tiež nazýva miera diskriminácie alebo rozlišovacia schopnosť. Takzvané rozlíšenie označuje schopnosť mikroskopu rozlíšiť jemnú štruktúru kontrolovaného objektu. Je nepriamo úmerná vzdialenosti rozlíšenia. Vzdialenosť rozlíšenia sa vzťahuje na minimálnu vzdialenosť medzi dvoma bodmi objektu, ktoré možno rozlíšiť. Čím menšia je rozlišovacia vzdialenosť, tým vyššie je rozlíšenie mikroskopu. Ak je vzdialenosť medzi dvoma bodmi objektu menšia ako rozlišovacia vzdialenosť, tieto dva body sa budú mylne považovať za jeden bod a jeho štruktúra nebude jasne viditeľná. Rozlíšenie mikroskopu je určené šošovkou objektívu. Okuláre iba zväčšujú a nezvyšujú rozlíšenie mikroskopu.
V prípade normálneho centrálneho osvetlenia je rozlišovacia vzdialenosť d šošovky objektívu určená nasledujúcim vzorcom.
d=(λ/2)N.A.
Vo vzorci: d predstavuje vzdialenosť rozlíšenia, jednotka je mikrón, λ predstavuje vlnovú dĺžku osvetľovacieho svetla, jednotka je tiež mikrón.
Vo viditeľnom svetle je vlnová dĺžka s najväčším jasom a najcitlivejšou pre ľudské oči {{0}},55 μm a maximálna NA šošovky objektívu je 1,4. Po dosadení do vyššie uvedeného vzorca je d približne 0,2 μm. To znamená, že pri bežnom optickom mikroskope je hranica rozlišovacej vzdialenosti 0,2 μm v prípade centrálneho osvetlenia. To znamená, že bežné optické mikroskopy nedokážu rozlíšiť dva objekty menšie ako 0,2 μm.
Pomocou ultrafialového svetla je možné zmenšiť vlnovú dĺžku osvetľovacieho svetla, čo umožňuje dosah rozlíšenia 0,1 μm. Ale ultrafialové lúče ľudské oko nevidí. Dá sa to pozorovať až po odfotení.
Vlnová dĺžka toku elektrónov je iba 0,00387nm. Pomocou "elektrónovej šošovky" alebo magnetickej šošovky na riadenie toku elektrónov je rozlišovacia vzdialenosť elektrónového mikroskopu až niekoľko desatín nanometra. Môže sa použiť na pozorovanie štruktúry atómov.
(3) Zväčšenie
Zväčšenie mikroskopu sa rovná súčinu zväčšenia šošovky objektívu a zväčšenia okuláru. V zásade môže byť zväčšenie veľmi veľké. Ak však šošovka objektívu nedokáže rozlíšiť detaily preparátu, bez ohľadu na to, aké veľké je zväčšenie, nemá to význam. Teoreticky možno odvodiť, že najvhodnejšie zväčšenie mikroskopu (nazývané efektívne zväčšenie, reprezentované M efektívne) je medzi 500 a 1000-násobkom numerickej apertúry šošovky objektívu. To znamená, že 500 N.A. Menšie alebo rovné M efektívne Menšie alebo rovné 1000N.A.
V rámci efektívneho rozsahu zväčšenia môžu oči pozorovať dlhú dobu bez únavy. Ak je zväčšenie menšie ako 500 NA, bude ťažké ho pozorovať. Ak je vyššia ako 1000N.A., zhorší to kvalitu obrazu a dokonca spôsobí neskutočný obraz. Preto zväčšenie cez 1000N.A. sa nazýva neplatné zväčšenie.
(4) Pracovná vzdialenosť
Pracovná vzdialenosť sa vzťahuje na vzdialenosť medzi spodným povrchom šošovky objektívu a horným povrchom krycieho skla po zaostrení mikroskopu pri použití štandardného krycieho skla a štandardnej dĺžky mechanickej trubice. Čím väčšie je zväčšenie šošovky objektívu, tým kratšia je pracovná vzdialenosť. Vo všeobecnosti je pracovná vzdialenosť šošovky objektívu s nízkym výkonom pod 10-krát 5-7mm, zatiaľ čo pracovná vzdialenosť šošovky so 100-násobkom oleja je len asi 0,19 mm.
(5) Hĺbka ostrosti
Keď je mikroskop zaostrený na určitú rovinu vo vzorke, nie je možné jasne vidieť iba rovinu objektu, ale súčasne jasne vidieť aj hornú a dolnú rovinu objektu, ktoré sú s ňou spojené. Vzdialenosť medzi hornou a dolnou rovinou objektu sa nazýva hĺbka ostrosti alebo skrátene hĺbka ostrosti.
Hĺbka ostrosti mikroskopu je veľmi malá a čím väčšia je numerická apertúra, tým väčšie je celkové zväčšenie a tým menšia je hĺbka ostrosti. Napríklad pri použití olejovej šošovky s NA 1,25/100-krát a 12,5-násobným okulárom na pozorovanie je hĺbka ostrosti iba 0,27 μm. To znamená, že po zaostrení je naraz jasne vidieť len tenkú vrstvu s hrúbkou 0,27 μm. Bežné vzorky sú vo všeobecnosti hrubé niekoľko mikrónov. Aby ste videli celý preparát, je potrebné použiť dolaďovací mechanizmus mikroskopu na pozorovanie vo vrstvách zhora nadol.
(6) zorné pole
Zorné pole sa nazýva aj zorné pole. Vzťahuje sa na rozsah kontrolovaného objektu, ktorý môže mikroskop vidieť naraz. Väčšinou chceme, aby zorné pole bolo čo najväčšie. Zorné pole mikroskopu je určené zorným poľom šošovky objektívu a zorným poľom okuláru. Zorné pole bežnej šošovky objektívu je menšie ako 20 mm a veľké môže dosiahnuť viac ako 40 mm. Zorné pole bežných 10x okulárov je 14 mm a veľké môžu dosiahnuť viac ako 24 mm. Po skonštruovaní objektívu a okuláru sa ich zorné pole zafixuje. Pretože zorné pole všeobecného mikroskopu je malé, nie je možné vidieť celý preparát v jednom zornom poli, je vidieť len veľmi malý kruh na preparáte. Okrem toho je veľkosť zorného poľa nepriamo úmerná celkovému zväčšeniu mikroskopu. Čím väčšie je celkové zväčšenie, tým menšie je zorné pole. Riešením je použiť pohyb, aby každá časť preparátu postupne vstúpila do zorného poľa a postupne pozorovala.
(7) Jas zrkadla
Jas zrkadla sa vzťahuje na svetlosť a tmavosť obrazu objektu videného v mikroskope. Pre uľahčenie pozorovania dúfame, že výsledný obraz bude svetlejší. V prípade konštantného vonkajšieho svetla je jas zrkadla úmerný druhej mocnine numerickej apertúry a nepriamo úmerný druhej mocnine celkového zväčšenia. Aby bol obraz jasnejší, mala by sa použiť šošovka objektívu s veľkou numerickou apertúrou s okulárom s nízkym zväčšením. Napríklad v prípade rovnakej šošovky objektívu sa pri použití 5X okuláru vytvorí zrkadlový obraz, ktorý je 4-krát jasnejší ako pri použití 10X okuláru.
Pri mikroskopoch využívajúcich elektrické svetelné zdroje možno jas zrkadlového obrazu ovládať úpravou jasu iluminátora.
(8) Jasnosť
Čistota mikroskopického zobrazovania závisí od jeho optického systému, najmä od optického výkonu šošovky objektívu. Súvisí s návrhom, výrobou, používaním a skladovaním mikroskopov. Je to dôležitá a zložitá otázka. Z hľadiska používania a skladovania sú hlavné dôvody, ktoré ovplyvňujú prehľadnosť: hrúbka použitého krycieho skla je nekvalifikovaná, ohnisko nie je nastavené do ideálnej polohy, celkové zväčšenie je príliš veľké a šošovka oleja šošovka nie je zotretá. Čistota, pleseň šošovky atď.
