Čo je to dvojfotónová fluorescenčná mikroskopia
Základný princíp dvojfotónovej excitácie je: v prípade vysokej hustoty fotónov môžu fluorescenčné molekuly absorbovať dva fotóny s dlhou vlnovou dĺžkou súčasne a po krátkej dobe života v takzvanom excitovanom stave emitovať fotón s kratšou vlnovou dĺžkou. . ; efekt je rovnaký ako pri použití fotónu, ktorého vlnová dĺžka je polovica dlhej vlnovej dĺžky na excitáciu fluorescenčnej molekuly. Dvojfotónová excitácia vyžaduje vysokú hustotu fotónov. Aby nedošlo k poškodeniu buniek, dvojfotónová mikroskopia využíva vysokoenergetické pulzné lasery s uzamknutým režimom. Laser vyžarovaný týmto laserom má vysokú špičkovú energiu a nízku priemernú energiu, jeho šírka pulzu je iba 100 femtosekúnd a jeho frekvencia môže dosiahnuť 80 až 100 megahertzov. Pri použití šošovky objektívu s vysokou numerickou apertúrou na zaostrenie fotónov pulzného lasera je hustota fotónov v ohnisku šošovky objektívu najvyššia a k dvojfotónovej excitácii dochádza iba v ohnisku šošovky objektívu, takže dvojfotónový mikroskop nepotrebuje konfokálnu dierku, čo zlepšuje účinnosť detekcie fluorescencie.
Vo všeobecných fluorescenčných javoch môže fluorescenčná molekula v dôsledku nízkej hustoty fotónov excitačného svetla absorbovať iba jeden fotón v rovnakom čase a potom emitovať fluorescenčný fotón cez radiačný prechod, čo je jednofotónová fluorescencia. Pre proces fluorescenčnej excitácie s použitím lasera ako zdroja svetla môže nastať dvojfotónová alebo dokonca viacfotónová fluorescencia. V tomto čase je intenzita použitého zdroja excitačného svetla vysoká a hustota fotónov spĺňa požiadavky fluorescenčných molekúl absorbujúcich dva fotóny súčasne. V procese použitia všeobecného lasera ako zdroja excitačného svetla hustota fotónov stále nestačí na vytvorenie fenoménu dvojfotónovej absorpcie. Väčšinou sa používa femtosekundový pulzný laser a jeho okamžitý výkon môže dosahovať rádovo megawatty. Preto je vlnová dĺžka dvojfotónovej fluorescencie kratšia ako vlnová dĺžka excitačného svetla, čo je ekvivalentné efektu vyvolanému excitáciou pri polovičnej vlnovej dĺžke excitácie.
